Nature.com сайтад зочилсонд баярлалаа. Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь CSS дэмжлэг хязгаарлагдмал байна. Хамгийн сайн үр дүнд хүрэхийн тулд бид танд хөтчийнхөө шинэ хувилбарыг ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer дээр Тохиромжтой байдлын горимыг идэвхгүй болгох). Энэ хооронд тасралтгүй дэмжлэг үзүүлэхийн тулд бид сайтыг хэв маяг эсвэл JavaScriptгүйгээр харуулж байна.
Байгалийн гаралтай бүтээгдэхүүнийг нээж, ашигтайгаар ашиглах нь хүний амьдралыг сайжруулахад тусалдаг. Ургамлын өсөлтийг дарангуйлах химийн бодисыг хогийн ургамлыг хянахын тулд гербицид болгон өргөн ашигладаг. Төрөл бүрийн гербицидийг ашиглах шаардлагатай тул шинэ үйлчлэх механизмтай нэгдлүүдийг тодорхойлох шаардлагатай байна. Энэхүү судалгаанд бид Streptomyces werraensis MK493-CF1-ээс шинэ N-алкоксипиррол нэгдэл болох кумамонамид нээж, бүрэн синтезийн процессыг тогтоосон. Биологийн идэвхжилийн шинжилгээгээр бид урс-моноамийн хүчил нь урс-моноамидын синтетик завсрын бүтээгдэхүүн бөгөөд ... болохыг тогтоожээ.ургамлын өсөлтийн дарангуйлагчҮүнээс гадна бид HeLa эсийн өсөлтөд сөргөөр нөлөөлөхгүйгээр өндөр гербицид үйлчилгээтэй урбенилокси дериватив (UDA) зэрэг янз бүрийн урбеноны хүчлийн деривативуудыг боловсруулсан. Мөн бид урмотоник хүчлийн деривативууд нь ургамлын микротубулуудыг тасалдуулдаг болохыг тогтоосон; үүнээс гадна KAND нь актин судалтай хэсгүүдэд нөлөөлж, эсийн үхлийг өдөөдөг; Эдгээр олон талт нөлөө нь мэдэгдэж буй микротубулын дарангуйлагчдаас ялгаатай бөгөөд урсоны хүчлийн үйлчлэх шинэ механизмыг санал болгодог бөгөөд энэ нь шинэ гербицид боловсруулахад чухал давуу тал болдог.
Байгалийн гаралтай ашигтай бүтээгдэхүүн болон тэдгээрийн уламжлалыг нээж, практикт хэрэглэх нь хүний амьдралын чанарыг сайжруулах хэрэгсэл юм. Бичил биетэн, ургамал, шавьжнаас үүссэн хоёрдогч метаболитууд нь анагаах ухаан, хөдөө аж ахуйд томоохон дэвшилд хүргэсэн. Байгалийн гаралтай бүтээгдэхүүнээс олон антибиотик болон лейкемийн эсрэг эмүүдийг боловсруулсан. Үүнээс гадна, янз бүрийн төрлийнпестицид, фунгицид болон гербицидийг эдгээр байгалийн гаралтай бүтээгдэхүүнээс хөдөө аж ахуйд ашиглах зорилгоор гаргаж авдаг. Ялангуяа хогийн ургамлын хяналтын гербицид нь орчин үеийн хөдөө аж ахуйд ургацын ургацыг нэмэгдүүлэх чухал хэрэгсэл бөгөөд янз бүрийн төрлийн нэгдлүүдийг аль хэдийн арилжааны зорилгоор ашиглаж байна. Ургамлын хэд хэдэн эсийн процессууд, тухайлбал фотосинтез, амин хүчлийн солилцоо, эсийн ханын нийлэгжилт, митозын зохицуулалт, фитогормоны дохиолол, эсвэл уургийн нийлэгжилтийг гербицидийн ердийн бай гэж үздэг. Микротубулын үйл ажиллагааг дарангуйлдаг нэгдлүүд нь митозын зохицуулалтад нөлөөлж ургамлын өсөлтөд нөлөөлдөг нийтлэг гербицидийн ангилал юм2.
Микротубулууд нь цитоскелетийн бүрэлдэхүүн хэсгүүд бөгөөд эукариот эсүүдэд өргөн хадгалагддаг. Тубулины гетеродимер нь α-тубулин ба β-тубулинаас бүрдэх бөгөөд шугаман микротубулын протофиламент үүсгэдэг бөгөөд 13 протофиламент нь цилиндр хэлбэртэй бүтэц үүсгэдэг. Микротубулууд нь ургамлын эсүүдэд эсийн хэлбэр, эсийн хуваагдал, эсийн доторх тээвэрлэлтийг тодорхойлох зэрэг олон үүрэг гүйцэтгэдэг3,4. Ургамлын эсүүд нь фазын хоорондох плазмын мембраны доор микротубулуудыг агуулдаг бөгөөд эдгээр кортикал микротубулууд нь целлюлозын синтазын цогцолборыг зохицуулах замаар целлюлозын микрофибрилүүдийн зохион байгуулалтыг хянадаг гэж үздэг4,5. Үндэсний үзүүрийн хурдан сунах бүсэд орших үндэсний эпидермисийн эсийн кортикал микротубулууд нь хажуу тийш байрладаг бөгөөд целлюлозын микрофибрүүд нь эдгээр микротубулуудыг дагаж, эсийн тэлэлтийн чиглэлийг хязгаарлаж, улмаар анизотроп эсийн суналтыг дэмждэг. Тиймээс микротубулын үйл ажиллагаа нь ургамлын морфологитой нягт холбоотой байдаг. Тубулиныг кодчилдог генүүд дэх амин хүчлийн орлуулалт нь Арабидопсис 6,7-д кортикал микротубулын массивын гажуудал болон зүүн эсвэл баруун талын өсөлтийг үүсгэдэг. Үүнтэй адилаар, микротубулын динамикийг зохицуулдаг микротубултай холбоотой уургуудын мутаци нь үндэсний өсөлтийг гажуудуулж болзошгүй8,9,10,11,12,13. Үүнээс гадна, претилахлор гэгддэг дисопирамид зэрэг микротубулыг тасалдуулдаг гербицидээр эмчлэх нь зүүн талын ташуу үндэсний өсөлтийг үүсгэдэг14. Эдгээр өгөгдөл нь ургамлын өсөлтийн чиглэлийг тодорхойлоход микротубулын үйл ажиллагааны нарийн зохицуулалт чухал болохыг харуулж байна.
Микротубулын дарангуйлагчдын янз бүрийн төрлийг нээсэн бөгөөд эдгээр эмүүд нь цитоскелетийн судалгаа, түүнчлэн хөдөө аж ахуй, анагаах ухаанд чухал хувь нэмэр оруулсан2. Ялангуяа оризалин, динитроанилины нэгдлүүд, дисопирамид, бензамидтай холбоотой нэгдлүүд болон тэдгээрийн аналогууд нь микротубулын үйл ажиллагааг дарангуйлж, улмаар ургамлын өсөлтийг саатуулдаг. Тиймээс тэдгээрийг гербицид болгон өргөн хэрэглэдэг. Гэсэн хэдий ч микротубулууд нь ургамал, амьтны эсийн чухал бүрэлдэхүүн хэсэг тул ихэнх микротубулын дарангуйлагчид нь эсийн хоёр төрөлд цитотоксик нөлөө үзүүлдэг. Тиймээс гербицид гэж хүлээн зөвшөөрөгдсөн ашигтай хэдий ч практик зорилгоор хязгаарлагдмал тооны микротубулын эсрэг бодисыг ашигладаг.
Streptomyces нь Streptomyces овгийн нэг төрөл бөгөөд аэроб, грам эерэг, судалтай бактериудыг агуулдаг бөгөөд олон төрлийн хоёрдогч метаболит үүсгэх чадвараараа алдартай. Тиймээс энэ нь биологийн идэвхт шинэ байгалийн гаралтай бүтээгдэхүүний хамгийн чухал эх үүсвэрүүдийн нэг гэж тооцогддог. Одоогийн судалгаагаар бид Streptomyces werraensis MK493-CF1 болон S. werraensis ISP 5486-аас ялгаж авсан кумамонамид хэмээх шинэ нэгдлийг нээсэн. Спектрийн шинжилгээ болон бүрэн спектрийн шинжилгээг ашиглан кумамонамидын бүтцийг тодорхойлж, түүний өвөрмөц N-алкоксипирролын араг ясыг тодорхойлсон. Урсмонамидын синтетик завсрын бүтээгдэхүүн болох урсмонийн хүчил нь алдартай загвар ургамлын Арабидопсис thaliana-ийн өсөлт, соёололтыг дарангуйлдаг болохыг тогтоожээ. Бүтэц-идэвхтэй байдлын хамаарлын судалгаагаар бид урсоны хүчилд хувиргасан C9 агуулсан урсоны хүчлийн нонилокси дериватив (KAND) гэж нэрлэгддэг нэгдэл нь өсөлт, соёололтыг дарангуйлах нөлөөг мэдэгдэхүйц нэмэгдүүлдэг болохыг тогтоожээ. Шинээр нээгдсэн ургамлын өсөлтийн дарангуйлагч нь тамхи болон элэгний ургалтад нөлөөлж, бактери эсвэл HeLa эсүүдэд цитотоксик нөлөө үзүүлээгүй болохыг тэмдэглэх нь зүйтэй. Түүнчлэн, зарим урмотон хүчлийн деривативууд нь гажуудсан үндэсний фенотипийг өдөөдөг бөгөөд эдгээр деривативууд нь микротубулуудад шууд болон шууд бусаар нөлөөлдөг гэсэн үг юм. Энэхүү санаатай нийцэж байгаа тул иммуногистохимийн эсвэл флуоресцент уургаар тэмдэглэгдсэн микротубулуудын бидний ажиглалт нь KAND эмчилгээ нь микротубулуудыг деполимержүүлдэг болохыг харуулж байна. Үүнээс гадна, кумамотон хүчлийн деривативаар эмчлэх нь актин микрофиламентийг тасалдуулсан. Тиймээс бид өвөрмөц үйлчлэх механизм нь цитоскелетийг устгахтай холбоотой шинэ ургамлын өсөлтийн дарангуйлагчийг нээсэн.
MK493-CF1 омгийг Токиогийн Шинагава-ку хотод хөрснөөс ялгаж авсан. MK493-CF1 омог нь сайн салаалсан стромын мицели үүсгэсэн. 16S рибосомын РНХ генийн хэсэгчилсэн дарааллыг (1422 bp) тодорхойлсон. Энэ омог нь S. werraensis-тэй маш төстэй (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: ердийн омог, 99.93%). Энэ үр дүнд үндэслэн энэ омог нь S. werraensis-ийн төрлийн омогтой нягт холбоотой болохыг тогтоосон. Тиймээс бид энэ омгийг S. werraensis MK493-CF1 гэж түр хугацаагаар нэрлэсэн. S. werraensis ISP 5486T нь мөн ижил биологийн идэвхт нэгдлүүдийг үүсгэдэг. Энэхүү бичил биетнээс байгалийн гаралтай бүтээгдэхүүн гаргаж авах талаар эрт үеийн судалгаа бага байсан тул цаашид химийн судалгаа хийсэн. S. werraensis MK493-CF1-ийг арвайн орчинд 30°C-д хатуу төлөвт исгэх аргаар 14 хоногийн турш өсгөвөрлөсний дараа орчныг 50% EtOH-оор гаргаж авсан. 59.5 мг түүхий ханд авахын тулд 60 мл дээжийг хатаасан. Түүхий хандыг урвуу фазын HPLC-д оруулж N-метокси-1H-пиррол-2-карбоксамидыг (1, кумамонамид гэж нэрлэгддэг, 36.0 мг) гарган авсан. 1-ийн нийт хэмжээ нь түүхий хандын ойролцоогоор 60% байна. Тиймээс бид кумамотоамидын 1-ийн шинж чанарыг нарийвчлан судлахаар шийдсэн.
Кумамонамид 1 нь цагаан аморф нунтаг бөгөөд өндөр нарийвчлалтай масс спектрометр (HRESIMS) нь C6H8N2O2-г баталгаажуулдаг (Зураг 1). Энэ нэгдлийн C2-орлуулсан пирролын хэлтэрхийг δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR спектрт: 4.5 Hz, H-5) болон δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) гэж тодорхойлдог бөгөөд 13C NMR спектр нь дөрвөн sp2 нүүрстөрөгчийн атом байгааг харуулж байна. C2 байрлалд амидын бүлгийн байгааг δC 161.1-д C-3 протоноос амидын карбонил нүүрстөрөгч хүртэлх HMBC корреляциар үнэлсэн. Үүнээс гадна, δH 4.10 (3H, S) болон δC 68.3-д 1 H ба 13C NMR оргилууд нь молекулд N-метокси бүлгүүд байгааг харуулж байна. Хэдийгээр метокси бүлгийн зөв байрлалыг сайжруулсан дифференциал спектроскопи болон цөмийн Overhauser товчлол (NOEDF) зэрэг спектроскопийн шинжилгээгээр хараахан тогтоогоогүй байсан ч N-метокси-1H-пиррол-2-карбоксамид анхны нэр дэвшигч нэгдэл болсон.
1-ийн зөв бүтцийг тодорхойлохын тулд нийт синтезийг хийсэн (Зураг 2a). Худалдаанд байгаа 2-аминопиридин 2-ыг m-CPBA-тай боловсруулснаар тоон гарцаар харгалзах N-оксид 3 гарсан. 2-ийг 2-аминоазиджуулсны дараа Абрамовичийн тодорхойлсон циклоконденсацийн урвалыг бензолд 90°C-д явуулж, хүссэн 1-гидрокси-1H-пиррол-2-карбонитрил 5-ийг граммаар гарган авсан. Хурд 60% (хоёр үе шаттай). 15,16. Дараа нь 4-ийг метилжүүлж, гидролиз хийснээр 1-метокси-1H-пиррол-2-карбоксилын хүчил ("кумотоник хүчил" гэж нэрлэдэг, 6) сайн гарцтай (70%, хоёр үе шаттай) үүссэн. Эцэст нь, усан аммиак ашиглан хүчил хлоридын завсрын 6-аар амиджуулах нь Кумамото амид 1-ийг 98% гарцтай болгосон. Синтезжүүлсэн 1-ийн бүх спектрийн өгөгдөл нь тусгаарлагдсан 1-тэй төстэй байсан тул 1-ийн бүтцийг тодорхойлсон;
Урбенамид ба урбен хүчлийн биологийн идэвхжилийн ерөнхий синтез ба шинжилгээ. (a) Кумамото амидын нийт синтез. (b) Долоо хоногийн настай зэрлэг хэлбэрийн Арабидопсис Колумбиа (Col) суулгацыг заасан концентрацид кумамонамид 6 эсвэл кумамонамид 1 агуулсан Мурашиге болон Скүүг (MS) ялтсан дээр ургуулсан. Хуваарийн хэмжээ = 1 см.
Эхлээд бид урбенамид болон түүний завсрын бүтээгдэхүүний ургамлын өсөлтийг зохицуулах чадварыг үнэлэв. Бид янз бүрийн концентрацитай урсонамид 1 буюу урсоны хүчил 6-г MS агар орчинд нэмж, энэ орчинд Арабидопсис талиана суулгацыг өсгөвөрлөв. Эдгээр шинжилгээгээр 6-ийн өндөр концентраци (500 μM) нь үндэсний өсөлтийг саатуулдаг болохыг харуулсан (Зураг 2b). Дараа нь бид 6-ийн N1 байрлалыг орлуулан янз бүрийн дериватив үүсгэж, тэдгээрийн бүтэц-идэвхжлийн хамаарлын судалгааг хийсэн (аналог синтезийн процессыг Нэмэлт Мэдээлэлд (SI) тайлбарласан болно). Арабидопсис суулгацыг 50 μM урсоны хүчлийн дериватив агуулсан орчинд ургуулж, үндэсний уртыг хэмжсэн. Зураг 3a, b, S1-д үзүүлсэнчлэн кумамо хүчил нь N1 байрлалд шугаман алкокси гинж (9, 10, 11, 12, 13) эсвэл том алкокси гинж (15, 16, 17)-ийн өөр өөр урттай байна. Деривативууд нь үндэсний өсөлтийг мэдэгдэхүйц дарангуйлсан. Үүнээс гадна, 200 μM 10, 11, эсвэл 17-г хэрэглэх нь соёололтыг дарангуйлдаг болохыг бид тогтоосон (Зураг 3c ба S2).
Кумамото амид болон холбогдох нэгдлүүдийн бүтэц-идэвхжлийн хамаарлыг судлах. (a) Аналогуудын бүтэц ба синтезийн схем. (b) 50 μM кумамонамидын деривативтай эсвэл деривативгүй MS орчинд ургуулсан 7 хоногийн суулгацын үндэсний уртыг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлох. Од тэмдэг нь хуурамч боловсруулалттай (t тест, p) мэдэгдэхүйц ялгааг харуулж байна.<0.05).n>18. Өгөгдлийг дундаж ± SD гэж харуулав. nt нь үрийн 50%-иас илүү нь соёолж чадаагүй тул "туршиж үзээгүй" гэсэн утгатай. (c) 200 μM кумамонамид болон холбогдох нэгдлүүдтэй эсвэл тэдгээргүйгээр MS орчинд 7 хоног инкубацалсан боловсруулсан үрийн соёололтын түвшинг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлно. Од тэмдэг нь хуурамч боловсруулалттай (хи-квадрат тест) мэдэгдэхүйц ялгааг харуулж байна. n=96.
Сонирхолтой нь, C9-ээс урт алкил хажуугийн гинжийг нэмэх нь дарангуйлах идэвхийг бууруулсан бөгөөд энэ нь кумамотой хүчилтэй холбоотой нэгдлүүд биологийн идэвхээ харуулахын тулд тодорхой хэмжээтэй хажуугийн гинж шаарддаг болохыг харуулж байна.
Бүтэц-идэвхжлийн хамаарлын шинжилгээгээр C9 нь урсоны хүчил болж өөрчлөгдсөн бөгөөд урсоны хүчлийн нонилокси дериватив (цаашид KAND 11 гэх) нь ургамлын өсөлтийн хамгийн үр дүнтэй дарангуйлагч болохыг харуулсан тул бид KAND 11-ийн илүү нарийвчилсан шинж чанарыг хийсэн. Arabidopsis-ийг 50 μM KAND 11-ээр эмчлэх нь соёололтыг бараг бүрэн зогсоосон бол KAND 11-ийн бага концентраци (40, 30, 20 эсвэл 10 μM) нь тунгаас хамааралтай байдлаар үндэсний өсөлтийг саатуулсан (Зураг 4a, b). KAND 11 нь үндэсний меристемийн амьдрах чадварт нөлөөлж байгаа эсэхийг шалгахын тулд бид пропидиум иодид (PI)-ээр будсан үндэсний меристемийг шалгаж, меристемийн талбайн хэмжээг хэмжсэн. 25 μM KAND-11 агуулсан орчинд тариалсан суулгацын меристемийн хэмжээ 151.1 ± 32.5 μм байсан бол DMSO агуулсан хяналтын орчинд тариалсан суулгацын меристемийн хэмжээ 264.7 ± 30.8 μм байсан (Зураг 4c, d), энэ нь KAND-11 нь эсийн идэвхжилийг сэргээдэг болохыг харуулж байна. тархалт. Үндэсний меристем. Үүнтэй уялдуулан KAND 11 эмчилгээ нь үндэсний меристем дэх эсийн хуваагдлын маркер CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS дохионы хэмжээг бууруулсан (Зураг 4e) 17. Эдгээр үр дүнгүүд нь KAND 11 нь эсийн үржлийн идэвхжилийг бууруулснаар үндэсний өсөлтийг дарангуйлдаг болохыг харуулж байна.
Урбеноны хүчлийн деривативууд (урбенилокси деривативууд)-ийн өсөлтөд үзүүлэх дарангуйлах нөлөөллийн шинжилгээ. (a) KAND 11-ийн заасан концентрацитай MS хавтан дээр ургуулсан 7 хоногийн зэрлэг төрлийн Кол суулгац. Хуваарийн баар = 1 см. (b) Үндэсний уртын тоон үзүүлэлт. Үсэг нь мэдэгдэхүйц ялгааг харуулж байна (Tukey HSD тест, p<0.05).n>16. Өгөгдлийг дундаж ± SD гэж харуулав. (c) 25 μM KAND-тай эсвэл KAND-гүй MS хавтан дээр ургуулсан пропидиум иодидоор будсан зэрлэг хэлбэрийн Col үндэсний конфокал микроскоп 11. Цагаан хаалтууд нь үндэсний меристемийг заана. Хуваарийн мөр = 100 μm. (d) Үндэсний меристемийн хэмжээг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлох (n = 10-11). Статистикийн зөрүүг t-тест ашиглан тодорхойлсон (p< 0.05). Баарнууд нь меристемийн дундаж хэмжээг илэрхийлнэ. (e) CDKB2 бүтцийг агуулсан үндэсний меристемийн дифференциал интерференцийн контраст (DIC) микроскоп; 1pro: CDKB2; 25 µM KAND шинжилгээтэй эсвэл шинжилгээгүйгээр MS хавтан дээр ургуулсан 5 хоногийн суулгац дээр 1-GUS будсан болон будсан.
KAND 11-ийн ургамлын хоруу чанарыг өөр нэг хоёр бутлаг ургамал болох тамхи (Nicotiana tabacum) болон газрын ургамлын гол загвар организм болох элэгний өвс (Marchantia polymorpha) ашиглан цаашид туршиж үзсэн. Arabidopsis-ийн нэгэн адил 25 μM KAND 11 агуулсан орчинд ургуулсан тамхины SR-1 суулгац нь богино үндэстэй болсон (Зураг 5a). Нэмж дурдахад, 48 үрийн 40 нь 200 μM KAND 11 агуулсан хавтан дээр соёолсон бол бүх 48 үр нь хуурамч боловсруулсан орчинд соёолсон нь KAND-ийн өндөр концентраци мэдэгдэхүйц байгааг харуулж байна (p<0.05; хи тест -квадрат) нь тамхины соёололтыг дарангуйлсан. (Зураг 5b). Үүнээс гадна, элэгний өвсөнд бактерийн өсөлтийг дарангуйлсан KAND 11-ийн концентраци нь Арабидопсис дахь үр дүнтэй концентрацитай төстэй байсан (Зураг 5c). Эдгээр үр дүнгээс харахад KAND 11 нь янз бүрийн ургамлын өсөлтийг дарангуйлж чадна. Дараа нь бид баавгайн моноамидтой холбоотой нэгдлүүдийн бусад организмууд, тухайлбал хүний HeLa эсүүд болон Escherichia coli омгийн DH5α-ийн цитотоксик чанарыг тус тус дээд зэрэглэлийн амьтан, бактерийн эсүүдийн төлөөлөгч гэж судалсан. Эсийн үржлийн хэд хэдэн шинжилгээнд бид кумамонамид 1, кумамонамидын хүчил 6, KAND 11 нь 100 μM концентрацид HeLa эсвэл E. coli эсийн өсөлтөд нөлөөлөөгүй болохыг ажигласан (Зураг 5d,e).
Arabidopsis бус организмд KAND 11-ийн өсөлтийг дарангуйлах. (a) Хоёр долоо хоногийн настай зэрлэг хэлбэрийн SR-1 тамхины суулгацыг 25 μM KAND 11 агуулсан босоо байрлалтай MS хавтан дээр ургуулсан. (b) Хоёр долоо хоногийн настай зэрлэг хэлбэрийн SR-1 тамхины суулгацыг 200 μM KAND 11 агуулсан хэвтээ байрлалтай MS хавтан дээр ургуулсан. (c) KAND 11-ийн заасан концентрацитай Gamborg B5 хавтан дээр ургуулсан хоёр долоо хоногийн настай зэрлэг хэлбэрийн Tak-1 элэгний нахиа. Улаан сумнууд нь хоёр долоо хоногийн инкубацийн хугацаанд ургахаа больсон спорыг заана. (d) HeLa эсийн эсийн үржлийн шинжилгээ. Амьд эсийн тоог эсийн тооллын хэрэгсэл 8 (Dojindo) ашиглан тодорхой хугацааны интервалаар хэмжсэн. Хяналтын хувьд HeLa эсийг РНХ полимеразын транскрипцийг дарангуйлж, эсийн үхэлд хүргэдэг 5 μg/ml актиномицин D (D үйлдэл)-ээр эмчилсэн. Шинжилгээг гурван удаа хийсэн. (e) E. coli эсийн үржлийн шинжилгээ. E. coli-ийн өсөлтийг OD600-г хэмжих замаар шинжилсэн. Хяналтын хувьд эсүүдийг бактерийн эсийн ханын нийлэгжилтийг дарангуйлдаг 50 мкг/мл ампициллин (Amp)-аар эмчилсэн. Шинжилгээг гурван удаа хийсэн.
Урамидтай холбоотой нэгдлүүдийн улмаас үүссэн цитотоксик нөлөөллийн үйлчлэх механизмыг тайлахын тулд бид дунд зэргийн дарангуйлах нөлөөтэй урбений хүчлийн деривативуудыг дахин шинжилсэн. Зураг 2b, 6a-д үзүүлсэнчлэн, урмотоник хүчил 6-ийн өндөр концентраци (200 μM) агуулсан агар хавтан дээр ургуулсан суулгац нь богино, зүүн муруй үндэс үүсгэдэг (θ = – 23.7 ± 6.1), харин хяналтын орчинд ургуулсан суулгацын суулгац нь бараг шулуун үндэс үүсгэдэг (θ = – 3.8 ± 7.1). Энэхүү онцлог ташуу өсөлт нь кортикал микротубулын үйл ажиллагааны алдагдалаас үүдэлтэй болох нь мэдэгдэж байна14,18. Энэхүү олдвортой нийцэж байгаа нь микротубулыг тогтворгүйжүүлэх эмүүд болох дисопирамид ба оризалин нь бидний өсөлтийн нөхцөлд ижил төстэй үндэс хазайлтыг өдөөсөн (Зураг 2b, 6a). Үүний зэрэгцээ бид урмотоник хүчлийн деривативуудыг туршиж, тодорхой концентрацид ташуу үндэсний өсөлтийг өдөөсөн хэд хэдэн зүйлийг сонгосон. 8, 9, 15-р нэгдлүүд нь тус тус 75 μM, 50 μM, 40 μM-д үндэсний өсөлтийн чиглэлийг өөрчилсөн нь эдгээр нэгдлүүд нь микротубулуудыг үр дүнтэй тогтворгүйжүүлж болохыг харуулж байна (Зураг 2b, 6a). Мөн бид хамгийн хүчтэй урсолын хүчлийн дериватив болох KAND 11-ийг бага концентрацид (15 μM) туршиж үзээд KAND 11-ийг хэрэглэх нь үндэсний өсөлтийг саатуулдаг бөгөөд үндэсний өсөлтийн чиглэл жигд бус боловч зүүн тийш хазайх хандлагатай байгааг тогтоосон (Зураг C3). Микротубулыг тогтворгүйжүүлдэг эмийн өндөр концентраци нь заримдаа үндэс хазайхаас илүү ургамлын өсөлтийг саатуулдаг тул бид дараа нь үндэсний эпидермисийн эсүүд дэх кортикал микротубулуудыг ажигласнаар KAND 11 нь микротубулуудад нөлөөлөх магадлалыг үнэлсэн. 25 μM KAND 11-ээр эмчилсэн суулгацын үндэсний эпидермисийн эсүүдэд β-тубулины эсрэгбие ашиглан иммуногистохимийн шинжилгээгээр суналтын бүсэд эпидермисийн эсүүдэд бараг бүх кортикал микротубулууд алга болсныг харуулсан (Зураг 6b). Эдгээр үр дүнгээс харахад кумамотоны хүчил болон түүний уламжлалууд нь микротубулуудад шууд болон шууд бусаар нөлөөлж тэдгээрийг тасалдуулж, эдгээр нэгдлүүд нь шинэ микротубулын дарангуйлагчид болохыг харуулж байна.
Урсоны хүчил болон түүний уламжлалууд нь Arabidopsis thaliana-ийн кортикал микротубулуудыг өөрчилдөг. (a) Заасан концентрацид янз бүрийн урмотоны хүчлийн уламжлал байгаа үед үндэсний налуугийн өнцөг хэмжсэн. Микротубулуудыг дарангуйлдаг гэж мэдэгдэж буй хоёр нэгдэл болох дисопирамид ба оризалиныг мөн шинжилсэн. Оруулгад үндэсний өсөлтийн өнцгийг хэмжихэд ашигласан стандартыг харуулав. Од тэмдэг нь хуурамч эмчилгээтэй (t тест, p) мэдэгдэхүйц ялгааг харуулж байна.<0.05).n>19. Хуваарийн шугам = 1 см. (b) Суналтын бүс дэх эпидермисийн эсүүдийн кортикал микротубулууд. 25 μM KAND 11-тэй эсвэл KAND 11-гүй MS хавтан дээр ургуулсан зэрлэг хэлбэрийн Arabidopsis Col үндэстний микротубулуудыг β-тубулины анхдагч эсрэгбие болон Alexa Fluor-conjugated хоёрдогч эсрэгбие ашиглан иммуногистохимийн будгаар дүрсэлсэн. Хуваарийн шугам = 10 μm. (c) Үндэс меристем дэх микротубулуудын митоз бүтэц. Микротубулуудыг иммуногистохимийн будгаар дүрсэлсэн. Профазын бүс, ээрмэл, фрагмопласт зэрэг митоз бүтцийг конфокал зургаас тоолсон. Сумнууд нь митоз микротубулын бүтцийг заана. Оддын тэмдэг нь хуурамч эмчилгээтэй мэдэгдэхүйц ялгааг заана (t тест, p<0.05).n>9. Хуваарийн шугам = 50 µм.
Урса нь микротубулын үйл ажиллагааг тасалдуулах чадвартай боловч түүний үйлчлэх механизм нь ердийн микротубулын деполимержих бодисуудаас өөр байх төлөвтэй байна. Жишээлбэл, дисопирамид ба оризалин зэрэг микротубулын деполимержих бодисын өндөр концентраци нь эпидермисийн эсийн анизотроп тэлэлтийг өдөөдөг бол KAND 11 нь үүсгэдэггүй. Үүнээс гадна, KAND 11 болон дисопирамидыг хамт хэрэглэх нь дисопирамидаар өдөөгдсөн үндэсний өсөлтийн хариу урвалыг үүсгэж, KAND 11-ээр өдөөгдсөн өсөлтийн дарангуйллыг ажигласан (Зураг S4). Мөн бид хэт мэдрэг дисопирамид 1-1 (phs1-1) мутант KAND 11-д үзүүлэх хариу урвалыг шинжилсэн. phs1-1 нь каноник бус тубулин киназын цэгийн мутацитай бөгөөд дисопирамид9,20-аар эмчлэхэд богино үндэс үүсгэдэг. KAND 11 агуулсан агар орчинд ургуулсан phs1-1 мутант суулгац нь дисопирамид дээр ургуулсантай төстэй богино үндэстэй байв (Зураг S5).
Үүнээс гадна, бид KAND 11-ээр эмчилсэн суулгацын үндэсний меристемд профазын бүс, ээрмэл, фрагмопласт зэрэг митоз микротубулын бүтцийг ажигласан. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-ийн ажиглалттай нийцүүлэн митоз микротубулын тоо мэдэгдэхүйц буурсан нь ажиглагдсан (Зураг .6c).
KAND 11-ийн эсийн доорх нягтрал дахь цитотоксик чанарыг тодорхойлохын тулд бид тамхины BY-2 суспензийн эсийг KAND 11-ээр эмчилж, тэдгээрийн хариу урвалыг ажигласан. Бид эхлээд KAND 11-ийн бор гадаргын микротубулуудад үзүүлэх нөлөөг үнэлэхийн тулд микротубулыг флуоресцент байдлаар тэмдэглэдэг TagRFP-TUA6 илэрхийлдэг BY-2 эсүүдэд KAND 11-ийг нэмсэн. Бор гадаргын микротубулын нягтралыг дүрсний шинжилгээ ашиглан үнэлсэн бөгөөд энэ нь цитоплазмын пикселүүдийн дунд цитоскелетийн пикселийн хувийг тоон үзүүлэлтээр илэрхийлсэн. Шинжилгээний үр дүнгээс харахад 50 μM эсвэл 100 μM KAND 11-ээр 1 цагийн турш эмчилсний дараа нягтрал нь тус тус 0.94 ± 0.74% эсвэл 0.23 ± 0.28% болж мэдэгдэхүйц буурсан бол DMSO-оор эмчилсэн эсийн нягтрал 1.61 ± 0.34% байв (Зураг 7a). Эдгээр үр дүн нь KAND 11 эмчилгээ нь кортикал микротубулуудын деполимержилтийг өдөөдөг гэсэн Арабидопсис судалгааны ажиглалттай нийцэж байна (Зураг 6b). Бид мөн KAND 11-ийн ижил концентрацитай боловсруулсны дараа GFP-ABD-шошготой актин судалтай BY-2 шугамыг судалж, KAND 11 эмчилгээ нь актин судалуудыг тасалдуулсан болохыг ажигласан. 50 μM эсвэл 100 μM KAND 11-ээр 1 цагийн турш боловсруулснаар актин судалтай нягтрал тус тус 1.20 ± 0.62% эсвэл 0.61 ± 0.26% болж мэдэгдэхүйц буурсан бол DMSO-оор боловсруулсан эсүүдийн нягтрал 1.69 ± 0.51% байв (Зураг 2). 7b). Эдгээр үр дүн нь актин судалтай холбоотой пропизамид болон микротубулуудад нөлөөлдөггүй актин деполимеризатор болох латрункулин В-ийн нөлөөтэй зөрчилдөж байна (SI Зураг S6). Үүнээс гадна, кумамонамид 1, кумамонамидын хүчил 6, эсвэл KAND 11-ээр эмчлэх нь HeLa эсийн микротубулуудад нөлөөлөөгүй (SI Зураг S7). Тиймээс KAND 11-ийн үйлчлэх механизм нь мэдэгдэж буй цитоскелетийн эвдрэл үүсгэгчдээс өөр гэж үздэг. Үүнээс гадна, KAND 11-ээр эмчилсэн BY-2 эсийн микроскопийн ажиглалтаар KAND 11 эмчилгээний үед эсийн үхэл эхэлснийг илрүүлсэн бөгөөд Эвансын цэнхэр будгаар будсан үхсэн эсийн эзлэх хувь KAND 11 эмчилгээний 30 минутын дараа мэдэгдэхүйц нэмэгдээгүй бол 50 μM эсвэл 100 μM KAND-ээр 90 минутын эмчилгээ хийсний дараа үхсэн эсийн тоо тус тус 43.7% эсвэл 80.1% болж нэмэгдсэн болохыг харуулсан (Зураг 7c). Эдгээр өгөгдлүүдийг нэгтгэн авч үзвэл шинэ урсолын хүчлийн дериватив KAND 11 нь өмнө нь тодорхойгүй байсан үйлчлэх механизмтай ургамлын өвөрмөц цитоскелетийн дарангуйлагч болохыг харуулж байна.
KAND нь тамхины BY-2 эсийн бор гадаргын микротубул, актин судалтай утас болон амьдрах чадварт нөлөөлдөг. (a) TagRFP-TUA6-ийн дэргэд BY-2 эсүүд дэх бор гадаргын микротубулыг дүрслэн харуулах. KAND 11 (50 μM эсвэл 100 μM) эсвэл DMSO-оор эмчилсэн BY-2 эсүүдийг конфокал микроскопоор шалгасан. Бор гадаргын микротубулын нягтралыг 25 бие даасан эсийн микрографаас тооцоолсон. Үсэг нь мэдэгдэхүйц ялгааг харуулж байна (Tukey HSD тест, p< 0.05). Хуваарийн шугам = 10 µм. (b) GFP-ABD2-ийн дэргэд дүрслэгдсэн BY-2 эсүүд дэх кортикал актин судалтай хэсгүүд. KAND 11 (50 μM эсвэл 100 μM) эсвэл DMSO-оор эмчилсэн BY-2 эсүүдийг конфокал микроскопоор шалгасан. Кортикал актин судалтай хэсгүүдийн нягтралыг 25 бие даасан эсийн микрографаас тооцоолсон. Үсэг нь мэдэгдэхүйц ялгааг харуулж байна (Tukey HSD тест, p< 0.05). Хуваарийн шугам = 10 µm. (c) Үхсэн BY-2 эсийг Эвансын цэнхэр будгаар ажигласан. KAND 11 (50 µM эсвэл 100 µM) эсвэл DMSO-оор эмчилсэн BY-2 эсүүдийг тод талбайн микроскопоор шалгасан. n=3. Хуваарийн шугам = 100 µm.
Байгалийн шинэ бүтээгдэхүүнийг нээж, хэрэглэснээр анагаах ухаан, хөдөө аж ахуй зэрэг хүний амьдралын янз бүрийн салбарт томоохон дэвшил гарсан. Байгалийн нөөцөөс ашигтай нэгдлүүдийг гаргаж авахын тулд түүхэн судалгаа хийгдсэн. Ялангуяа актиномицетууд нь нематодын эсрэг шимэгч хорхойн эсрэг антибиотик болгон ашигтай байдаг нь мэдэгдэж байгаа бөгөөд эдгээр нь ивермектиний хар тугалган нэгдэл болох авермектин болон блеомицин болон түүний уламжлалуудыг хорт хавдрын эсрэг бодис болгон анагаах ухаанд ашигладаг21,22. Үүнтэй адилаар актиномицетуудаас янз бүрийн ургамал устгах нэгдлүүдийг нээсэн бөгөөд зарим нь аль хэдийн арилжааны зорилгоор ашиглагдаж байна1,23. Тиймээс хүссэн биологийн идэвхжилтэй байгалийн бүтээгдэхүүнийг ялгаж авахын тулд актиномицет метаболитуудыг шинжлэх нь үр дүнтэй стратеги гэж тооцогддог. Энэхүү судалгаанд бид S. werraensis-ээс кумамонамид хэмээх шинэ нэгдлийг нээж, амжилттай синтезлэсэн. Урсоны хүчил нь урбенамидын болон түүний уламжлалуудын синтетик завсрын бүтээгдэхүүн юм. Энэ нь үндэс муруйх, дунд зэргийн хүчтэй ургамал устгах үйлчилгээтэй, ургамлын микротубулуудыг шууд болон шууд бусаар гэмтээж болно. Гэсэн хэдий ч урмотон хүчлийн үйлчлэх механизм нь одоо байгаа микротубулын дарангуйлагчдаас өөр байж болно, учир нь KAND 11 нь актин судалтай эсийг тасалдуулж, эсийн үхэлд хүргэдэг бөгөөд энэ нь урмотон хүчил болон түүний уламжлалууд нь цитоскелетийн олон янзын бүтцэд нөлөөлдөг зохицуулалтын механизмыг харуулж байна.
Урбеноны хүчлийн цаашдын нарийвчилсан шинж чанар нь урбеноны хүчлийн үйлчлэх механизмыг илүү сайн ойлгоход тусална. Ялангуяа дараагийн зорилго бол урсоны хүчил нь буурсан микротубулуудтай холбогдох чадварыг үнэлэх, урсоны хүчил болон түүний деривативууд нь микротубулуудад шууд үйлчилж, деполимержих эсэхийг, эсвэл тэдгээрийн үйлчлэл нь микротубулын тогтворгүйжилтэд хүргэдэг эсэхийг тодорхойлох явдал юм. Үүнээс гадна, микротубулууд нь шууд бай биш тохиолдолд ургамлын эсүүд дээрх урсоны хүчлийн үйлчлэх газар болон молекулын байг тодорхойлох нь холбогдох нэгдлүүдийн шинж чанар, гербицидийн идэвхийг сайжруулах боломжит аргуудыг илүү сайн ойлгоход тусална. Бидний био идэвхжилийн шинжилгээгээр урсоны хүчлийн Arabidopsis thaliana, тамхи, элэгний ургамал зэрэг ургамлын ургалтад үзүүлэх өвөрмөц цитотоксик чадварыг харуулсан боловч E. coli болон HeLa эсүүд аль алинд нь нөлөөлөөгүй. Хэрэв урсоны хүчлийн деривативуудыг задгай газар тариалангийн талбайд ашиглах гербицид болгон боловсруулсан бол амьтны эсэд хоргүй эсвэл бага зэрэг хордуулах нь давуу тал юм. Үнэндээ микротубулууд нь эукариотуудад түгээмэл бүтэцтэй тул ургамалд тэдгээрийн сонгомол дарангуйлал нь гербицидийн гол шаардлага юм. Жишээлбэл, тубулинтай шууд холбогдож, полимержилтийг дарангуйлдаг микротубулын деполимержүүлэгч бодис болох пропизамид нь амьтны эсэд бага хоруу чанартай тул гербицид болгон ашигладаг24. Дизопирамидаас ялгаатай нь холбогдох бензамидууд нь өөр өөр бай өвөрмөц чанартай байдаг. Ургамлын микротубулуудаас гадна RH-4032 эсвэл бензоксамид нь амьтны эс буюу оомицетийн микротубулуудыг тус тус дарангуйлдаг бөгөөд залиламид нь бага фитотоксик чанартай тул фунгицид болгон ашигладаг25,26,27. Шинээр нээгдсэн баавгай болон түүний уламжлалууд нь ургамлын эсрэг сонгомол цитотоксик шинж чанартай байдаг боловч цаашид өөрчлөлт хийх нь тэдний бай өвөрмөц байдлыг өөрчилж, эмгэг төрүүлэгч мөөгөнцөр буюу оомицетийг хянах нэмэлт деривативуудыг бий болгож болзошгүйг тэмдэглэх нь зүйтэй.
Урбеноны хүчил болон түүний уламжлалуудын өвөрмөц шинж чанарууд нь тэдгээрийг гербицид болгон хөгжүүлэх, судалгааны хэрэгсэл болгон ашиглахад ашигтай байдаг. Цитоскелетийн ургамлын эсийн хэлбэрийг хянах ач холбогдлыг өргөнөөр хүлээн зөвшөөрдөг. Өмнөх судалгаагаар ургамал нь морфогенезийг зохих ёсоор хянахын тулд микротубулын динамикийг хянах замаар кортикал микротубулын зохион байгуулалтын нарийн төвөгтэй механизмыг хөгжүүлсэн болохыг харуулсан. Микротубулын үйл ажиллагааг зохицуулах үүрэгтэй олон тооны молекулуудыг тодорхойлсон бөгөөд холбогдох судалгаа одоо ч үргэлжилж байна3,4,28. Ургамлын эс дэх микротубулын динамикийн талаарх бидний одоогийн ойлголт нь кортикал микротубулын зохион байгуулалтын механизмыг бүрэн тайлбарлаагүй байна. Жишээлбэл, дисопирамид ба оризалин хоёулаа микротубулыг деполимержүүлж чаддаг ч дисопирамид нь үндэсний ноцтой гажуудлыг үүсгэдэг бол оризалин харьцангуй бага нөлөө үзүүлдэг. Түүнээс гадна, микротубулыг тогтворжуулдаг тубулины мутаци нь үндэст декстроротаци үүсгэдэг бол микротубулын динамикийг тогтворжуулдаг паклитаксел нь нөлөөлдөггүй. Тиймээс урсолын хүчлийн молекулын байг судалж, тодорхойлох нь ургамлын бор гадаргын микротубулуудын зохицуулалтын талаар шинэ ойлголт өгөх ёстой. Үүнтэй адилаар, дисопирамид зэрэг гажуудсан өсөлтийг дэмжихэд үр дүнтэй химийн бодисууд болон оризалин эсвэл кумамоторын хүчил зэрэг үр дүн багатай химийн бодисуудын ирээдүйн харьцуулалт нь гажуудсан өсөлт хэрхэн явагддагийг харуулах сэжүүрийг өгөх болно.
Нөгөөтэйгүүр, хамгаалалттай холбоотой цитоскелетийн өөрчлөлт нь урсоны хүчлийн цитотоксик чанарыг тайлбарлах өөр нэг боломж юм. Эмгэг төрүүлэгчийн халдвар эсвэл ургамлын эсэд өдөөгч бодис оруулах нь заримдаа цитоскелетийг устгаж, улмаар эсийн үхэлд хүргэдэг29. Жишээлбэл, оомицетээс гаралтай криптоксантин нь KAND эмчилгээнд тохиолддогтой төстэй тамхины эсийн үхлийн өмнө микротубул болон актин судалтай хэсгүүдийг тасалдуулдаг гэж мэдээлсэн30,31. Урсоны хүчлээр өдөөгдсөн хамгаалалтын хариу урвал ба эсийн хариу урвалын хоорондох ижил төстэй байдал нь биднийг тэдгээр нь нийтлэг эсийн процессыг өдөөдөг гэсэн таамаглал дэвшүүлэхэд хүргэсэн боловч криптоксантинаас илүү урсоны хүчлийн илүү хурдан бөгөөд хүчтэй нөлөө илэрхий байна. Гэсэн хэдий ч судалгаагаар актин судалтай хэсгүүдийн тасалдал нь эсийн аяндаа үхлийг дэмждэг бөгөөд энэ нь үргэлж микротубулын тасалдалтай хамт байдаггүй29 болохыг харуулсан. Үүнээс гадна, урсоны хүчлийн деривативууд шиг эмгэг төрүүлэгч эсвэл өдөөгч нь үндэсний өсөлтийг гажуудуулдаг эсэхийг харах л үлдлээ. Тиймээс хамгаалалтын хариу урвал болон цитоскелетийг холбосон молекулын мэдлэг нь шийдвэрлэх шаардлагатай сонирхол татахуйц асуудал юм. Урсоны хүчилтэй холбоотой бага молекул жинтэй нэгдлүүд болон янз бүрийн чадавхитай олон төрлийн деривативуудыг ашигласнаар тэдгээр нь үл мэдэгдэх эсийн механизмыг онилох боломжийг олгож магадгүй юм.
Микротубулын динамикийг зохицуулдаг шинэ нэгдлүүдийг нээж, хэрэглэх нь ургамлын эсийн хэлбэрийг тодорхойлоход үндэслэсэн нарийн төвөгтэй молекулын механизмыг шийдвэрлэх хүчирхэг аргуудыг бий болгоно. Энэ хүрээнд микротубул болон актин судалтай хэсгүүдэд нөлөөлж, эсийн үхлийг өдөөдөг саяхан боловсруулсан урмотоник хүчил нэгдэл нь микротубулын хяналт болон эдгээр бусад механизмын хоорондын холбоог тайлах боломжийг олгож магадгүй юм. Тиймээс урбеноны хүчил ашиглан химийн болон биологийн шинжилгээ хийх нь ургамлын цитоскелетыг хянадаг молекулын зохицуулалтын механизмыг ойлгоход бидэнд туслах болно.
S. werraensis MK493-CF1-ийг 2% (w/v) галактоз, 2% (w/v) эссенцийн паста, 1% (w/v) Бакто найрлагаас бүрдсэн 110 мл үрийн тэжээлт орчинтой 500 мл-ийн гажуудсан Эрленмейер колбонд тарина. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) эрдэнэ шишийн ханд (KOGOSTCH Co., Ltd., Япон), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 болон 0.2% CaCO3-ийг ионгүйжүүлсэн усанд хийнэ (ариутгахаас өмнө рН 7.4). Үрийн өсгөврийг 27°C-д 2 өдрийн турш эргэлдэгч сэгсрэгч дээр (180 эрг/мин) инкубацлав. Хатуу төлөвт исгэх замаар үйлдвэрлэлийг тариална. Үрийн өсгөврийг (7 мл) 15 гр шахсан арвай (MUSO Co., Ltd., Япон) болон 25 гр ионгүйжүүлсэн ус (ариутгахаас өмнө рН-ийг тохируулаагүй) агуулсан 40 гр үйлдвэрлэлийн орчин агуулсан 500 мл-ийн К-1 колбонд шилжүүлсэн. Исгэлтийг 30°C-д харанхуй газар 14 хоногийн турш явуулсан. Исгэлтийн материалыг 40 мл/шил EtOH-оор гаргаж аваад центрифугээр (1500 гр, 4°C, 10 минут) центрифугээр хийсэн. Өсгөврийн дээд давхаргыг (60 мл) 10% MeOH/EtOAc-ийн холимогоор гаргаж авсан. Органик давхаргыг багасгасан даралтын дор ууршуулж үлдэгдэл (59.5 мг) гаргаж авсан бөгөөд үүнийг урвуу фазын багана (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 мм × урт 250 мм) дээр градиент элюци (0–10 минут: 90%) бүхий HPLC-д хамруулсан. H2O/CH3CN, 10–35 минут: 90% H2O/CH3CN-ээс 70% H2O/CH3CN (градиент), 35–45 минут: 90% H2O/EtOH, 45–155 минут: 90% H2O/EtOH-ээс 100% EtOH (градиент (градиент), 155–200 минут: 100% EtOH) хүртэл 1.5 мл/мин урсгалын хурдаар, кумамонамид (1, 36.0 мг)-ийг цагаан аморф нунтаг болгон ялгасан.
Кумамотоамид(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Гц, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Гц 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Гц, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ тооцоолсон утга: 141.0659, хэмжсэн утга: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 см–1.
Колумбын үрийг (Col-0) судалгааны зориулалтаар Арабидопсис Биологийн Нөөцийн Төвөөс (ABRC) судалгааны зориулалтаар авсан. Col-0 үрийг манай лабораторийн нөхцөлд үржүүлж, хадгалж, зэрлэг төрлийн Арабидопсис ургамал болгон ашигласан. Арабидопсис үрийг гадаргуугийн ариутгал хийж, 2% сахароз (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-морфолино)этансульфоны хүчил (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) болон 1.5% агар (Fujifilm Wako Pure Chemical) агуулсан хагас бат бөх Мурашиге болон Скоог орчинд, рН 5.7, 23 °C температурт, тогтмол гэрэлд өсгөвөрлөв. phs1-1 мутант үрийг Т. Хашимото (Нара Шинжлэх ухаан, технологийн хүрээлэн) нийлүүлсэн.
SR-1 омгийн үрийг Т. Хашимото (Нарагийн Шинжлэх ухаан, технологийн хүрээлэн) нийлүүлж, зэрлэг тамхины ургамал болгон ашигласан. Тамхины үрийг гадаргууг ариутгаж, соёололтыг дэмжихийн тулд гурван шөнийн турш ариутгасан усанд дэвтээгээд, дараа нь 2% сахароз, 0.05% (w/v) MES, 0.8% геллан бохь (Fujifilm Wako Pure Chemical) Мурашиге. болон Скоог орчин) агуулсан рН 5.7 бүхий хагас бат бөх уусмалд хийж, 23°C-д тогтмол гэрлийн дор инкубацлав.
Так-1 омгийг Т. Кохчи (Киотогийн Их Сургууль) нийлүүлсэн бөгөөд элэгний судалгааны стандарт туршилтын нэгж болгон ашигласан. Жеммаг ариутгасан өсгөвөрлөсөн ургамлаас гаргаж аваад, дараа нь 1% сахароз, 0.3% геллан бохь агуулсан Gamborg B5 орчин (Fujifilm Wako Pure Chemical) дээр бүрж, 23°C-д тасралтгүй гэрлийн дор өсгөвөрлөв.
Тамхины BY-2 эсүүдийг (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) С. Хасезава (Токиогийн Их Сургууль) нийлүүлсэн. BY-2 эсүүдийг өөрчлөгдсөн Линсмейер болон Скугийн орчинд 95 дахин шингэлж, долоо хоног бүр 2,4-дихлорфеноксиацетик хүчилээр 32 нэмж оруулсан. Эсийн суспензийг харанхуйд 27°C температурт 130 эрг/мин хурдтайгаар эргэлдэгч сэгсрэгч дээр хольсон. Эсийг шинэхэн орчны эзэлхүүнээс 10 дахин их хэмжээгээр угааж, ижил орчинд дахин суспензлэнэ. Цэцэгт байцааны мозайк вирус 35S промоторын дор TagRFP-TUA6 микротубулын маркер эсвэл GFP-ABD2 актин судалтай маркерыг тогтвортой илэрхийлдэг BY-2 трансген эсийн шугамуудыг тайлбарласны дагуу үүсгэсэн33,34,35. Эдгээр эсийн шугамуудыг анхны BY-2 эсийн шугамд ашигласантай төстэй процедуруудыг ашиглан хадгалж, синхрончилж болно.
HeLa эсүүдийг 37°C инкубаторт 5% CO2-той 10% ургийн үхрийн ийлдэс, 1.2 U/мл пенициллин, 1.2 мкг/мл стрептомициноор баяжуулсан Дулбеккогийн өөрчлөгдсөн Ийгл орчинд (DMEM) (Life Technologies) өсгөвөрлөв.
Энэхүү гар бичмэлд дурдсан бүх туршилтыг Японы биоаюулгүй байдлын дүрэм журам, удирдамжийн дагуу гүйцэтгэсэн.
Нэгдлүүдийг диметил сульфоксид (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical)-д үндсэн уусмал болгон уусгаж, Арабидопсис болон тамхины хувьд MS орчинд, эсвэл элэгний хувьд Gamborg B5 орчинд шингэлсэн. Үндэсийн өсөлтийг дарангуйлах шинжилгээнд хавтан бүрт 10-аас дээш үрийг заасан нэгдлүүд буюу DMSO агуулсан агар орчинд тарьсан. Үрийг өсөлтийн камерт 7 хоног инкубацалсан. Суулгацын зургийг авч, үндэсний уртыг хэмжсэн. Арабидопсис соёололтын шинжилгээнд хавтан бүрт 48 үрийг 200 μM нэгдэл буюу DMSO агуулсан агар орчинд тарьсан. Арабидопсис үрийг өсөлтийн камерт ургуулж, соёолж гарсан суулгацын тоог соёолж эхэлснээс хойш 7 хоногийн дараа (даг) тоолсон. Тамхины соёололтын шинжилгээнд хавтан бүрт 24 үрийг 200 μM KAND буюу DMSO агуулсан агар орчинд тарьсан. Тамхины үрийг өсөлтийн камерт ургуулж, соёолж авсан суулгацын тоог 14 хоногийн дараа тоолсон. Элэгний өсөлтийг дарангуйлах шинжилгээнд хавтан бүрээс 9 үр хөврөлийг KAND эсвэл DMSO-ийн заасан концентрацитай агар орчинд түрхэж, өсөлтийн камерт 14 хоног инкубацлав.
Үндэс меристемийн зохион байгуулалтыг дүрслэхийн тулд 5 мг/мл пропидиум иодид (PI)-ээр будсан суулгацыг ашиглана. PI дохиог TCS SPE конфокал лазер сканнердах микроскоп (Leica Microsystems) ашиглан флуоресценцийн микроскопоор ажигласан.
Үндсийг β-глюкуронидаза (GUS)-аар гистохимийн будгаар Малами болон Бенфей36 нарын тайлбарласан протоколын дагуу гүйцэтгэсэн. Суулгацыг 90% ацетонд нэг шөнийн турш бэхлээд, GUS буферт 0.5 мг/мл 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-d-глюкуроны хүчилээр 1 цагийн турш будаж, гидратжуулсан хлоральдегидийн уусмалд (8 г хлоралгидрат, 2 мл ус, 1 мл глицерол) хийж, Axio Imager M1 микроскоп (Carl Zeiss) ашиглан дифференциал интерференцийн контраст микроскопоор ажигласан.
Үндэсний өнцгийг босоо байрлуулсан тавцан дээр ургуулсан 7 хоногийн суулгац дээр хэмжсэн. 6-р алхамд тайлбарласны дагуу үндэсний өнцгийг таталцлын векторын чиглэлээс хэмжинэ.
Кортикал микротубулуудын зохион байгуулалтыг тайлбарласны дагуу ажигласан бөгөөд протокол 37-д бага зэрэг өөрчлөлт оруулсан. β-тубулины эсрэгбие (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) болон Alexa Fluor 488-тай холбогдсон хулганы эсрэг IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723)-ийг тус тус 1:1000 ба 1:100 шингэрүүлэлтээр анхдагч болон хоёрдогч эсрэгбие болгон ашигласан. Флуоресценцийн зургийг TCS SPE конфокал лазер сканнердах микроскоп (Leica Microsystems) ашиглан авсан. Z-стек зургийг авч, үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу хамгийн их эрчимтэй төсөөллийг үүсгэ.
HeLa эсийн үржлийн шинжилгээг үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу Cell Counting Kit 8 (Dojindo) ашиглан хийсэн.
E. coli DH5α-ийн өсөлтийг 600 нм (OD600) спектрофотометр ашиглан өсгөвөрт эсийн нягтралыг хэмжих замаар шинжилсэн.
Трансген BY-2 эсүүдийн цитоскелетийн зохион байгуулалтыг CSU-X1 конфокал сканнердах төхөөрөмж (Yokogawa) болон sCMOS камер (Zyla, Andor Technology)-аар тоноглогдсон флуоресценцийн микроскоп ашиглан ажигласан. Цитоскелетийн нягтралыг дүрсний шинжилгээгээр үнэлсэн бөгөөд энэ нь дүрсэлсэнчлэн ImageJ програм хангамжийг ашиглан конфокал зураг дахь цитоплазмын пикселүүдийн дунд цитоскелетийн пикселийн хувийг тоон үзүүлэлтээр илэрхийлсэн38,39.
BY-2 эсүүдэд эсийн үхлийг илрүүлэхийн тулд эсийн суспензийн нэг хэсгийг өрөөний температурт 10 минутын турш 0.05% Эванс хөхөөр инкубацлав. Үхсэн эсийг сонгомол Эванс хөх будалтаар будах нь амьд эсээс бүрэн бүтэн плазмын мембранаар будагч бодисыг шахаж гаргахаас хамаарна40. Будсан эсийг тод талбайн микроскоп (BX53, Olympus) ашиглан ажиглав.
HeLa эсүүдийг 37°C болон 5% CO2-т чийгшүүлсэн инкубаторт 10% FBS-ээр баяжуулсан DMEM-д ургуулсан. Эсүүдийг 37°C-т 6 цагийн турш 100 μM KAND 11, кумамонамик хүчил 6, кумамонамид 1, 100 нг/мл колцемид (Gibco), эсвэл 100 нг/мл Нокодмаз (Sigma)-аар боловсруулсан. Эсүүдийг өрөөний температурт 10 минутын турш MetOH-оор, дараа нь ацетатаар 5 минутын турш бэхэлсэн. Хөдөлгөөнгүй эсүүдийг 0.5% BSA/PBS-д шингэлсэн β-тубулины анхдагч эсрэгбие (1D4A4, Proteintech: 66240-1)-аар 2 цагийн турш инкубацид хийж, TBST-ээр 3 удаа угааж, дараа нь Alexa Fluor ямааны эсрэгбиеээр инкубацид хийсэн. 488 1 цаг. – Хулганы IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) болон 15 нг/мл 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI)-г 0.5% BSA/PBS-д шингэлсэн. TBST-ээр гурван удаа угаасны дараа будсан эсүүдийг Nikon Eclipse Ti-E урвуу микроскопоор ажигласан. Зургийг MetaMorph програм хангамж (Molecular Devices) ашиглан хөргөсөн Hamamatsu ORCA-R2 CCD камераар авсан.
Нийтэлсэн цаг: 2024 оны 6-р сарын 17