Nature.com сайтаар зочилсонд баярлалаа.Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь CSS-ийн дэмжлэгтэй байна.Хамгийн сайн үр дүнд хүрэхийн тулд хөтчийнхөө шинэ хувилбарыг ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer дээр нийцтэй байдлын горимыг идэвхгүй болгох).Энэ хооронд байнгын дэмжлэг үзүүлэхийн тулд бид сайтыг загварчлал эсвэл JavaScriptгүйгээр харуулж байна.
Байгалийн гаралтай бүтээгдэхүүнийг нээж, ашиг тустай ашиглах нь хүний амьдралыг сайжруулахад тусална.Ургамлын өсөлтийг дарангуйлах химийн бодисыг хогийн ургамлыг устгахад гербицид болгон өргөн ашигладаг.Төрөл бүрийн гербицидийг ашиглах хэрэгцээ шаардлагаас болж үйл ажиллагааны шинэ механизмтай нэгдлүүдийг тодорхойлох шаардлагатай байна.Энэхүү судалгаагаар бид Streptomyces werraensis MK493-CF1-ээс шинэ N-алкоксипирролын нэгдэл болох кумамонамидыг олж, нийлэгжилтийн бүрэн процессыг тогтоосон.Биологийн идэвхжилийн шинжилгээгээр бид urs-monoamic хүчил нь урс-моноамидын нийлэг завсрын бүтээгдэхүүн бөгөөд болзошгүй бодис болохыг олж мэдсэн.ургамлын өсөлтийг саатуулагч.Нэмж дурдахад бид урбенилокси дериватив (UDA) зэрэг төрөл бүрийн урбеноны хүчлийн деривативуудыг бүтээсэн бөгөөд энэ нь HeLa эсийн өсөлтөд сөргөөр нөлөөлдөггүй, гербицидийн өндөр идэвхжилтэй.Урмотоник хүчлийн деривативууд нь ургамлын микротубулуудыг тасалдуулж байгааг бид олж мэдсэн;Үүнээс гадна, KAND нь актин утаснуудад нөлөөлж, эсийн үхлийг өдөөдөг;Эдгээр олон талт үр нөлөө нь мэдэгдэж буй бичил гуурсан хоолойн дарангуйлагчдаас ялгаатай бөгөөд урсоны хүчлийн үйл ажиллагааны шинэ механизмыг санал болгодог бөгөөд энэ нь шинэ гербицидийг бий болгоход чухал давуу тал юм.
Байгалийн ашиг тустай бүтээгдэхүүн, тэдгээрийн уламжлалыг олж илрүүлэх, практикт ашиглах нь хүний амьдралын чанарыг сайжруулах хэрэгсэл юм.Бичил биетэн, ургамал, шавьжнаас үүссэн хоёрдогч метаболит нь анагаах ухаан, хөдөө аж ахуйд томоохон дэвшилд хүргэсэн.Байгалийн гаралтай бүтээгдэхүүнээс олон тооны антибиотик, цусны хорт хавдрын эсрэг эмүүдийг гаргаж авсан.Үүнээс гадна төрөл бүрийнпестицид, Хөдөө аж ахуйд ашиглахын тулд эдгээр байгалийн бүтээгдэхүүнээс фунгицид, гербицидийг гаргаж авдаг.Ялангуяа хогийн ургамалтай тэмцэх гербицид нь орчин үеийн хөдөө аж ахуйд үр тарианы ургацыг нэмэгдүүлэх чухал хэрэгсэл бөгөөд төрөл бүрийн нэгдлүүдийг аль хэдийн худалдаанд ашиглаж байна.Фотосинтез, амин хүчлийн солилцоо, эсийн хананы нийлэгжилт, митозын зохицуулалт, фитогормоны дохиолол, уургийн нийлэгжилт зэрэг ургамлын эсийн хэд хэдэн процессыг гербицидийн ердийн зорилт гэж үздэг.Микротубулын үйл ажиллагааг дарангуйлдаг нэгдлүүд нь митоз зохицуулалтад нөлөөлж, ургамлын өсөлтөд нөлөөлдөг гербицидүүдийн нийтлэг ангилал юм2.
Микротубулууд нь эсийн араг ясны бүрэлдэхүүн хэсэг бөгөөд эукариот эсүүдэд өргөн хадгалагддаг.Тубулин гетеродимер нь α-тубулин ба β-тубулинуудаас бүрдэх шугаман микротубулын протофиламентуудаас бүрдэх ба 13 протофиламент нь цилиндр хэлбэртэй бүтэцтэй.Микротубулууд нь ургамлын эсэд эсийн хэлбэр, эсийн хуваагдал, эсийн доторх тээвэрлэлтийг тодорхойлох зэрэг олон үүрэг гүйцэтгэдэг.Ургамлын эсүүд нь фазын плазмын мембраны доор микротубулуудыг агуулдаг бөгөөд эдгээр кортикал микротубулууд нь целлюлозын синтазын цогцолборуудын зохицуулалтаар целлюлозын микрофибрилүүдийн зохион байгуулалтыг удирддаг гэж үздэг4,5.Үндэсний эпидермисийн эсийн кортикал микро гуурсан хоолой нь үндсийн үзүүр хурдан сунах бүсэд байрладаг бөгөөд целлюлозын бичил утаснууд нь эдгээр микротубулуудыг дагаж эсийн тэлэлтийн чиглэлийг хязгаарлаж, улмаар анизотроп эсийн суналтыг дэмждэг.Тиймээс бичил гуурсан хоолойн үйл ажиллагаа нь ургамлын морфологитой нягт холбоотой байдаг.Тубулиныг кодлодог ген дэх амин хүчлийн орлуулалт нь кортикал микротубулын массивын хазайлт, Арабидопсис 6,7-ийн зүүн эсвэл баруун талын өсөлтийг үүсгэдэг.Үүний нэгэн адил бичил гуурсан хоолойн динамикийг зохицуулдаг микротубултай холбоотой уургийн мутаци нь үндэс ургалтыг гажуудуулж болно8,9,10,11,12,13.Түүнчлэн претилахлор гэгддэг дизопирамид гэх мэт бичил гуурсыг тасалдаг гербицидээр эмчлэх нь зүүн талын ташуу үндэс ургахад хүргэдэг14.Эдгээр өгөгдөл нь бичил гуурсан хоолойн үйл ажиллагааны нарийн зохицуулалт нь ургамлын өсөлтийн чиглэлийг тодорхойлоход чухал ач холбогдолтой болохыг харуулж байна.
Төрөл бүрийн бичил гуурсан хоолойн дарангуйлагчийг илрүүлсэн бөгөөд эдгээр эмүүд нь эсийн яс судлалын судалгаа, түүнчлэн хөдөө аж ахуй, анагаах ухаанд ихээхэн хувь нэмэр оруулсан2.Ялангуяа оризалин, динитроанилин нэгдлүүд, дизопирамид, бензамидтай холбоотой нэгдлүүд болон тэдгээрийн аналогууд нь микротубулын үйл ажиллагааг саатуулж, улмаар ургамлын өсөлтийг саатуулдаг.Тиймээс тэдгээрийг гербицид болгон өргөн ашигладаг.Гэсэн хэдий ч микротубулууд нь ургамал, амьтны эсийн чухал бүрэлдэхүүн хэсэг байдаг тул ихэнх микротубулын дарангуйлагчид хоёр төрлийн эсийн хувьд цитотоксик байдаг.Тиймээс гербицид гэж хүлээн зөвшөөрөгдсөн хэдий ч цөөн тооны нянгийн эсрэг бодисыг практик зорилгоор ашигладаг.
Streptomyces нь аэробик, грам эерэг, судалтай бактери агуулсан Streptomyces овгийн төрөл бөгөөд олон төрлийн хоёрдогч метаболит үүсгэх чадвараараа алдартай.Тиймээс энэ нь биологийн идэвхит байгалийн шинэ бүтээгдэхүүний хамгийн чухал эх үүсвэрийн нэг гэж тооцогддог.Энэ удаагийн судалгаагаар бид Streptomyces werraensis MK493-CF1 болон S. werraensis ISP 5486-аас тусгаарлагдсан кумамонамид хэмээх шинэ нэгдлийг нээсэн. Спектрийн шинжилгээ, бүрэн спектрийн шинжилгээг ашиглан кумамонамидын бүтэц, түүний өвөрмөц N-алкоксипирролийн араг ясыг тодорхойлсон. тодорхойлсон.синтез.Урсмоноамид ба түүний деривативуудын нийлэг завсрын бүтээгдэхүүн болох Урсмони хүчил нь Арабидопсис thaliana хэмээх алдартай загвар ургамлын өсөлт, соёололтыг саатуулдаг болохыг тогтоожээ.Бүтэц-үйл ажиллагааны харилцааны судалгаагаар урсоны хүчлийн nonyloxy дериватив (KAND) гэж нэрлэгддэг C9-ийн урсоны хүчил болж өөрчлөгдсөн нэгдэл нь өсөлт, соёололтыг дарангуйлах нөлөөг ихээхэн сайжруулдаг болохыг олж мэдсэн.Шинээр нээсэн ургамлын өсөлтийг дарангуйлагч нь тамхи, элэгний ургалтанд нөлөөлж, нян болон HeLa эсүүдэд цитотоксик биш байсан.Түүнчлэн зарим урмотоник хүчлийн деривативууд нь үндэс фенотипийг гажуудуулж, эдгээр деривативууд нь микротубулд шууд болон шууд бусаар нөлөөлдөг гэсэн үг юм.Энэ санаатай нийцэж байгаа нь иммуногистохимийн эсвэл флюресцент уураг бүхий бичил гуурсан хоолойнуудыг ажигласнаар KAND эмчилгээ нь микротубулуудыг деполимержүүлдэг болохыг харуулж байна.Үүнээс гадна, кумамотоник хүчлийн деривативтай эмчилгээ нь актин микрофиламентуудыг тасалдуулсан.Тиймээс бид өвөрмөц үйл ажиллагааны механизм нь эсийн араг ясыг устгахтай холбоотой ургамлын өсөлтийг дарангуйлагч шинэ бодисыг нээсэн.
Токиогийн Шинагава-ку дахь хөрснөөс MK493-CF1 омог ялгаж авсан.MK493-CF1 омог нь сайн салаалсан стромын мицели үүсгэдэг.16S рибосомын РНХ генийн хэсэгчилсэн дарааллыг (1422 bp) тодорхойлсон.Энэ омог нь S. werraensis-тэй маш төстэй (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: ердийн омог, 99.93%).Энэ үр дүнд үндэслэн энэ омог нь S. werraensis-ийн төрлийн омогтой нягт холбоотой болохыг тогтоосон.Тиймээс бид энэ омгийг S. werraensis MK493-CF1 гэж түр нэрлэсэн.S. werraensis ISP 5486T нь мөн адил биоидэвхтэй нэгдлүүдийг үйлдвэрлэдэг.Энэ бичил биетнээс байгалийн гаралтай бүтээгдэхүүн гарган авах судалгаа бага байсан тул цаашид химийн судалгаа хийсэн.S. werraensis MK493-CF1-ийг арвайн тэжээллэг орчинд 300С-т хатуу төлөвт исгэж 14 хоногийн турш тариалсны дараа 50%-ийн EtOH-тэй тэжээлийг гаргаж авсан.60 мл дээжийг хатааж 59.5 мг түүхий ханд гаргаж авсан.Түүхий хандыг урвуу фазын HPLC-д хамруулж N-метокси-1Н-пиррол-2-карбоксамид (1, кумамонамид нэртэй, 36.0 мг) гаргав.1-ийн нийт хэмжээ нь түүхий хандны ойролцоогоор 60% байна.Тиймээс бид кумамотоамид 1-ийн шинж чанарыг нарийвчлан судлахаар шийдсэн.
Кумамонамид 1 нь цагаан аморф нунтаг бөгөөд өндөр нарийвчлалтай масс спектрометр (HRESIMS) нь C6H8N2O2-ийг баталгаажуулдаг (Зураг 1).Энэ нэгдлийн C2 орлуулсан пирролын фрагмент нь δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Гц, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR спектрт: 4.5 Гц) -ээр тодорхойлогддог. , H-5) ба δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Гц, H-6) ба 13C NMR спектр нь дөрвөн sp2 нүүрстөрөгчийн атом байгааг харуулж байна.С2 байрлалд амидын бүлэг байгаа эсэхийг C-3 протоноос амид карбонилийн нүүрстөрөгч хүртэлх δC 161.1 хүртэлх HMBC корреляциар үнэлэв.Түүнчлэн, δH 4.10 (3H, S) ба δC 68.3-д 1 H ба 13 C NMR оргилууд нь молекулд N-метокси бүлэг байгааг харуулж байна.Метокси бүлгийн зөв байрлалыг сайжруулсан ялгаа спектроскопи болон цөмийн Overhauser товчлол (NOEDF) зэрэг спектроскопийн шинжилгээг ашиглан хараахан тогтоогоогүй байсан ч N-метокси-1Н-пиррол-2-карбоксамид нь анхны нэр дэвшигч нэгдэл болжээ.
1-ийн зөв бүтцийг тодорхойлохын тулд нийт синтезийг хийсэн (Зураг 2a).Худалдааны боломжтой 2-аминопиридин 2-ыг m-CPBA-тай боловсруулснаар тоон гарцын харгалзах N-оксид 3 гарсан.2-ын 2-аминоазиджуулалтын дараа Абрамовичийн тодорхойлсон циклоконденсацийн урвалыг 90 ° C-д бензолд хийж, хүссэн 1-гидрокси-1Н-пиррол-2-карбонитрил 5-ыг граммаар авсан.Хурд 60% (хоёр үе шат).15,16.Дараа нь 4-ийн метилжилт ба гидролиз нь 1-метокси-1Н-пиррол-2-карбоксилын хүчил ("кумотоник хүчил" гэж нэрлэдэг) -ийг сайн (70%, хоёр үе шаттай) өгдөг.Эцэст нь, усан аммиак ашиглан хүчил хлоридын завсрын 6-аар амиджуулсан нь Кумамото амид 1-ийг 98% -ийн гарцтай болгосон.Синтезийн 1-ийн бүх спектрийн өгөгдөл нь тусгаарлагдсан 1-тэй төстэй байсан тул 1-ийн бүтцийг тодорхойлсон;
Урбенамид ба урбений хүчлийн биологийн идэвхжилийн ерөнхий синтез, шинжилгээ.(a) Кумамото амидын нийт синтез.(б) Долоон хоногийн настай зэрлэг Арабидопсис Columbia (Кол) төрлийн суулгацыг заасан концентрацитай кумамонамид 6 эсвэл кумамонамид 1 агуулсан Мурашиге ба Скоог (MS) хавтан дээр ургуулсан.Хэмжээний мөр = 1 см.
Эхлээд бид урбенамид ба түүний завсрын бүтээгдэхүүний биологийн идэвхийг ургамлын өсөлтийг зохицуулах чадварыг үнэлэв.Бид урсмонамид 1 эсвэл урсмони хүчил 6-ийн янз бүрийн концентрацийг MS агарын орчинд нэмсэн бөгөөд энэ тэжээлт тэжээлт орчинд тариалсан Arabidopsis thaliana суулгацыг суулгасан.Эдгээр шинжилгээнүүд нь 6-ийн өндөр концентраци (500 μM) нь үндэс ургалтыг саатуулдаг болохыг харуулсан (Зураг 2b).Дараа нь бид 6-ын N1 байрлалыг орлуулах замаар янз бүрийн деривативуудыг үүсгэсэн ба тэдгээр дээр бүтэц-үйл ажиллагааны хамаарлын судалгаа хийсэн (аналог синтезийн үйл явцыг Дэмжих мэдээлэлд (SI) тайлбарласан болно).Арабидопсисын суулгацыг 50 мкМ урсоны хүчлийн дериватив агуулсан тэжээлт орчинд ургуулж, үндэс уртыг хэмжсэн.зураг дээр үзүүлсэн шиг.Зураг 3a, b, S1-д үзүүлснээр кумамо хүчлүүд нь N1 байрлалд шугаман алкокси гинж (9, 10, 11, 12, 13) эсвэл том алкокси гинж (15, 16, 17) өөр өөр урттай байдаг.Деривативууд нь үндэс ургалтыг мэдэгдэхүйц дарангуйлдаг болохыг харуулсан.Нэмж дурдахад бид 200 μM 10, 11, эсвэл 17 түрхэх нь соёололтыг саатуулдаг болохыг олж мэдсэн (Зураг 3c ба S2).
Кумамото амид ба холбогдох нэгдлүүдийн бүтэц-үйл ажиллагааны хамаарлыг судлах.(a) Аналогуудын бүтэц, синтезийн схем.(б) 50 мкМ кумамонамидын деривативтай эсвэл агуулаагүй MS тэжээлт орчинд ургуулсан 7 хоногийн настай суулгацын үндэс уртын тоон үзүүлэлт.Од нь хуурамч эмчилгээнээс ихээхэн ялгаатай байгааг харуулж байна (t тест, х< 0.05).n>18. Өгөгдлийг дундаж ± SD гэж үзүүлэв.nt гэдэг нь үрийн 50-иас дээш хувь нь соёолоогүй тул "туршилтанд ороогүй" гэсэн үг.(в) 200 мкм кумамонамид болон холбогдох нэгдлүүдтэй эсвэл агуулаагүй MS орчинд 7 хоногийн турш өсгөвөрлөсөн эмчилсэн үрийн соёололтыг тодорхойлох.Од тэмдэг нь хуурамч эмчилгээ (хи-квадрат тест)-ийн мэдэгдэхүйц ялгааг харуулж байна.n=96.
Сонирхолтой нь, С9-ээс урт алкилийн хажуугийн гинжийг нэмснээр дарангуйлах идэвхийг бууруулж, кумамотойн хүчилтэй холбоотой нэгдлүүд нь биологийн идэвхээ харуулахын тулд тодорхой хэмжээний хажуугийн гинж шаарддаг болохыг харуулж байна.
Бүтэц-үйл ажиллагааны хамаарлын шинжилгээ нь C9 нь урсоны хүчил болж өөрчлөгдсөн, урсоны хүчлийн нонилокси дериватив (цаашид KAND 11 гэх) нь ургамлын өсөлтийн хамгийн үр дүнтэй дарангуйлагч болохыг харуулсан тул бид KAND 11-ийн илүү нарийвчилсан шинж чанарыг харуулсан. Арабидопсисын эмчилгээ 50 μM-тэй KAND 11 нь соёололтоос бараг бүрэн сэргийлдэг бол бага концентраци (40, 30, 20, эсвэл 10 μM) KAND 11 нь тунгаас хамааралтай үндэс ургалтыг саатуулдаг (Зураг 4a, b).KAND 11 нь үндэс меристемийн амьдрах чадварт нөлөөлж байгаа эсэхийг шалгахын тулд бид пропидиум иодид (PI) -аар будсан үндэс меристемийг судалж, меристемийн талбайн хэмжээг хэмжсэн.25 мкМ КАНД-11 агуулсан тэжээлт тэжээлт тэжээлт тэжээлт тэжээлт тэжээлт ургамалд тарьсан суулгацын меристемийн хэмжээ 151.1 ± 32.5 μм байсан бол DMSO агуулсан хяналтын тэжээлт тэжээлт тэжээлт тэжээлт ургамалд тарьсан суулгацын меристемийн хэмжээ 264.7 ± 30.8 μм байна (Зураг 4c, d) , энэ нь KAND-11 нь эсийн үйл ажиллагааг сэргээдэг болохыг харуулж байна.тархаж байна.Үндэс меристем.Үүнтэй уялдуулан KAND 11 эмчилгээ нь үндсэн меристем дэх эсийн хуваагдлын маркер CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS дохионы хэмжээг багасгасан (Зураг 4e) 17.Эдгээр үр дүн нь KAND 11 нь эсийн өсөлтийн идэвхийг бууруулж, үндэс өсөлтийг саатуулдаг болохыг харуулж байна.
Урбеноны хүчлийн дериватив (урбенилокси дериватив) өсөлтийг дарангуйлах нөлөөний шинжилгээ.(a) KAND 11-ийн заасан концентрацитай MS хавтан дээр ургасан 7 хоногийн настай зэрлэг Col суулгац. Хуваарийн баар = 1 см.(б) Үндэс уртын тоон үзүүлэлт.Үсэг нь мэдэгдэхүйц ялгааг илэрхийлдэг (Тукей HSD тест, х< 0.05).n>16. Өгөгдлийг дундаж ± SD гэж үзүүлэв.(в) MS ялтсууд дээр 25 мкМ КАНД-тай эсвэл үгүй ургасан пропидиум иодидоор будсан зэрлэг төрлийн Колон үндэсийн бүдүүн микроскоп 11. Цагаан хаалт нь үндэс меристемийг заана.Хуваарийн мөр = 100 мкм.(г) Үндэс меристемийн хэмжээг тодорхойлох (n = 10-11).Статистикийн ялгааг t-тест ашиглан тодорхойлсон (х< 0.05).Баар нь меристемийн дундаж хэмжээг илэрхийлдэг.(e) CDKB2 бүтцийг агуулсан гол меристемийн дифференциал интерференцийн тодосгогч (DIC) микроскоп;1pro: CDKB2;MS хавтан дээр ургуулсан 5 хоногийн настай суулгацыг 25 μM KAND шинжилгээтэй эсвэл хийгээгүй тохиолдолд 1-GUS-аар будаж, будсан.
KAND 11-ийн ургамлын хоруу чанарыг өөр нэг хоёр талт ургамал болох тамхи (Nicotiana tabacum) болон хуурай газрын ургамлын гол загвар организм болох элэгний ургамал (Marchantia polymorpha) ашиглан цааш нь туршсан.Arabidopsis-ийн нэгэн адил 25 мкМ KAND 11 агуулсан тэжээлт орчинд тарьсан тамхины SR-1 суулгац нь богино үндэстэй болсон (Зураг 5а).Нэмж дурдахад 48 үрийн 40 нь 200 мкМ KAND 11 агуулсан ялтсууд дээр соёолж, харин 48 үр нь бүгд хуурамчаар боловсруулсан тэжээлт орчинд соёолсон нь KAND-ийн өндөр концентраци мэдэгдэхүйц байгааг харуулж байна (p).< 0.05;хи тест -квадрат) тамхины соёололтыг саатуулдаг.(Зураг 5б).Үүнээс гадна элэгний ургамал дахь нянгийн өсөлтийг саатуулдаг KAND 11-ийн концентраци нь Арабидопсисын үр дүнтэй концентрацитай төстэй байв (Зураг 5c).Эдгээр үр дүн нь KAND 11 нь төрөл бүрийн ургамлын өсөлтийг саатуулж болохыг харуулж байна.Дараа нь бид баавгайн моноамидтай холбоотой нэгдлүүдийн цитотоксик шинж чанарыг бусад организмууд, тухайлбал хүний HeLa эсүүд болон Escherichia coli омгийн DH5α-ийн дээд зэргийн амьтан, бактерийн эсийн төлөөлөл болгон судалсан.Цуврал эсийн үржлийн шинжилгээнд бид кумамонамид 1, кумамонамидын хүчил 6, КАНД 11 нь 100 мкм концентрацитай HeLa эсвэл E. coli эсийн өсөлтөд нөлөөлөөгүйг ажигласан (Зураг 5d,e).
Арабидопсисын бус организмд KAND 11-ийн өсөлтийг саатуулдаг.(a) Хоёр долоо хоногтой зэрлэг SR-1 төрлийн тамхины суулгацыг 25 мкм KAND 11 агуулсан босоо байрлалтай MS хавтан дээр ургуулсан. (б) Хоёр долоо хоног настай зэрлэг SR-1 тамхины суулгацыг хэвтээ байрлалтай дээр ургуулсан. 200 мкМ KAND 11 агуулсан MS ялтсууд. (в) Gamborg B5 хавтан дээр ургасан хоёр долоо хоногтой зэрлэг төрлийн Так-1 элэгний нахиа нь KAND 11-ийн заасан концентрацитай. Улаан сумнууд нь хоёр долоо хоногийн инкубацийн дотор ургахаа больсон споруудыг харуулж байна. хугацаа.(г) HeLa эсийн эсийн өсөлтийн шинжилгээ.Амьдрах чадвартай эсийн тоог тодорхой хугацааны интервалаар эс тоолох хэрэгсэл 8 (Дожиндо) ашиглан хэмжсэн.Хяналтын хувьд HeLa эсийг 5 мкг/мл актиномицин D (Act D) эмчилсэн бөгөөд энэ нь РНХ полимеразын транскрипцийг дарангуйлж, эсийн үхэлд хүргэдэг.Шинжилгээг гурав дахин хийсэн.(e) E. coli эсийн өсөлтийн шинжилгээ.E. coli өсөлтийг OD600 хэмжилтээр шинжилсэн.Хяналтын хувьд эсийг бактерийн эсийн хананы синтезийг дарангуйлдаг 50 мкг/мл ампициллин (Amp) -аар эмчилсэн.Шинжилгээг гурав дахин хийсэн.
Урамидтай холбоотой нэгдлүүдийн цитотоксик нөлөөний механизмыг тайлахын тулд бид дунд зэргийн дарангуйлах нөлөөтэй урбений хүчлийн деривативуудыг дахин шинжилсэн.зураг дээр үзүүлсэн шиг.Зураг 2b, 6a-д үзүүлснээр урмотоник хүчил 6-ийн өндөр концентраци (200 мкм) агуулсан агар хавтан дээр ургуулсан суулгацууд нь богино, зүүн муруй үндэс (θ = – 23.7 ± 6.1) үүсгэдэг бол хяналтын тэжээлт тэжээлт ургамал дээр тарьсан суулгацын хувьд суулгац бараг шулуун үндэстэй болсон (θ = – 3.8 ± 7.1).Энэхүү өвөрмөц ташуу өсөлт нь кортикал бичил гуурсан хоолойн үйл ажиллагааны доголдолтой холбоотой байдаг14,18.Энэхүү олдвортой нийцэж байгаагаар бичил гуурсыг тогтворгүйжүүлэх эм болох дизопирамид ба оризалин нь бидний өсөлтийн нөхцөлд ижил төстэй үндэс хазайлтыг өдөөдөг (Зураг 2b, 6a).Үүний зэрэгцээ бид урмотоник хүчлийн деривативуудыг туршиж үзээд тодорхой концентрацитай үед ташуу үндэс ургалтыг өдөөдөг хэд хэдэн зүйлийг сонгосон.8, 9, 15-р нэгдлүүд нь 75 μM, 50 μM, 40 μM-д үндэс ургах чиглэлийг өөрчилсөн нь эдгээр нэгдлүүд микротубулуудыг үр дүнтэй тогтворгүй болгож чадна гэдгийг харуулж байна (Зураг 2b, 6a).Бид мөн хамгийн хүчтэй урсолын хүчлийн дериватив болох KAND 11-ийг бага концентрацитай (15 мкм) туршсан ба KAND 11-ийг хэрэглэснээр үндэс ургалтыг саатуулж, зүүн тийш налуу хандлагатай байсан ч үндэс ургах чиглэл жигд бус байгааг олж мэдсэн ( Зураг C3)..Микротубулыг тогтворгүйжүүлэх эмийн өндөр концентраци нь заримдаа үндсийг хазайлгахаас илүүтэй ургамлын өсөлтийг саатуулдаг тул бид дараа нь KAND 11 нь эпидермисийн үндэсийн эсүүдийн кортикал микротубулуудыг ажигласнаар бичил гуурсан хоолойд нөлөөлөх боломжийг үнэлэв.25 μM KAND 11-ээр эмчилсэн суулгацын үндэсийн эпидермисийн эсэд эсрэг β-тубулины эсрэгбие ашиглан иммуногистохими нь сунгах бүсийн эпидермисийн эсүүдийн бараг бүх кортикал микро гуурсан хоолой алга болсныг харуулсан (Зураг 6б).Эдгээр үр дүн нь кумамотоны хүчил ба түүний деривативууд нь бичил гуурсан хоолойд шууд болон шууд бусаар нөлөөлж, тэдгээрийг тасалдуулж, эдгээр нэгдлүүд нь шинэ бичил гуурсан хоолойн дарангуйлагчид болохыг харуулж байна.
Ursonic хүчил ба түүний деривативууд нь Arabidopsis thaliana дахь кортикал микротубулуудыг өөрчилдөг.(a) Үндэсний хазайлтын өнцгийг заасан концентрацид янз бүрийн урмотоник хүчлийн деривативын дэргэд хэмжсэн.Микротубулыг дарангуйлдаг хоёр нэгдлүүдийн нөлөөг мөн шинжилсэн: дизопирамид ба оризалин.Дотор нь үндэс ургалтын өнцгийг хэмжихэд ашигладаг стандартыг харуулав.Од нь хуурамч эмчилгээнээс ихээхэн ялгаатай байгааг харуулж байна (t тест, х< 0.05).n>19. Хуваарийн мөр = 1 см.(б) Сунгах бүсэд эпидермисийн эсүүд дэх кортикал бичил гуурсан хоолой.Зэрлэг төрлийн Arabidopsis Col-ийн бичил гуурсан хоолойнуудыг MS ялтсууд дээр 25 мкм KAND 11-тэй эсвэл ургасан үндсийг β-тубулины анхдагч эсрэгбие болон Alexa Fluor-тай холбосон хоёрдогч эсрэгбие ашиглан иммуногистохимийн будгаар дүрсэлсэн.Хуваарийн мөр = 10 мкм.(в) Үндэс меристем дэх бичил гуурсан хоолойн митоз бүтэц.Микротубулуудыг иммуногистохимийн будгаар дүрсэлсэн.Профазын бүс, ээрэх ба фрагмопласт зэрэг митозын бүтцийг конфокаль зургуудаас тоолсон.Сумнууд нь митозын микротубулын бүтцийг заана.Од нь хуурамч эмчилгээнээс ихээхэн ялгаатай байгааг харуулж байна (t тест, х< 0.05).n>9. Хуваарийн мөр = 50 микрон.
Хэдийгээр Урса нь бичил гуурсан хоолойн үйл ажиллагааг тасалдуулах чадвартай боловч түүний үйл ажиллагааны механизм нь ердийн микротубулын деполимержүүлэгч бодисуудаас ялгаатай байх болно.Жишээлбэл, дизопирамид, оризалин зэрэг бичил гуурсан хоолойн деполимержүүлэгч бодисуудын өндөр концентраци нь эпидермисийн эсийн анизотроп тэлэлтийг өдөөдөг бол KAND 11 нь тийм биш юм.Үүнээс гадна KAND 11 ба дизопирамидыг хамт хэрэглэснээр дизопирамидаар өдөөгдсөн үндэс ургах хариу урвал үүсч, KAND 11-ээр өдөөгдсөн өсөлтийн дарангуйлал ажиглагдсан (Зураг S4).Мөн бид хэт мэдрэмтгий дизопирамид 1-1 (phs1-1) мутант KAND 11-д үзүүлэх хариу урвалд дүн шинжилгээ хийсэн. phs1-1 нь каноник бус тубулин киназын цэгийн мутацитай бөгөөд дизопирамидаар эмчлэхэд богино үндэс үүсгэдэг9,20.KAND 11 агуулсан агар тэжээлт орчинд ургуулсан phs1-1 мутант суулгац нь дизопирамид ургасантай төстэй богино үндэстэй байв (зураг S5).
Нэмж дурдахад бид KAND 11-ээр эмчилсэн суулгацын үндэс меристемд профазын бүс, булцуу, фрагмоплас зэрэг митозын микротубулын бүтцийг ажигласан. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-ийн ажиглалттай нийцэж байгаа нь мэдэгдэхүйц буурсан байна митозын микротубулын тоо ажиглагдсан (Зураг .6c).
KAND 11-ийн эсийн хоруу чанарыг тодорхойлохын тулд бид тамхины BY-2 суспензийн эсийг KAND 11-ээр эмчилж, тэдгээрийн хариу урвалыг ажиглав.Бид эхлээд KAND 11-ийг BY-2 эсүүд дээр бичил гуурсан хоолойд флюресцентээр тэмдэглэдэг TagRFP-TUA6-г илэрхийлсэн эсүүд дээр KAND 11-ийн кортикал микротубулд үзүүлэх нөлөөг үнэлэх зорилгоор нэмсэн.Кортикал бичил гуурсан хоолойн нягтралыг зургийн шинжилгээгээр үнэлдэг бөгөөд энэ нь цитоплазмын пикселүүдийн хоорондох эсийн араг ясны пикселийн эзлэх хувь хэмжээг тодорхойлдог.Шинжилгээний үр дүнгээс үзэхэд 50 μM буюу 100 μM KAND 11-тэй 1 цагийн турш эмчилгээ хийсний дараа нягтрал нь 0.94 ± 0.74% буюу 0.23 ± 0.28% болж мэдэгдэхүйц буурч, DMSO-тай эмчилсэн эсийн нягтрал ± 10.61 ± 3.3 байна. % (Зураг 7а).Эдгээр үр дүн нь Арабидопсисын ажиглалттай нийцэж байгаа бөгөөд KAND 11 эмчилгээ нь кортикал бичил гуурсан хоолойн деполимержилтийг өдөөдөг (Зураг 6б).Мөн бид KAND 11-ийн ижил концентрацитай эмчилгээ хийсний дараа GFP-ABD шошготой актин судалтай BY-2 шугамыг шалгаж, KAND 11-ийн боловсруулалт нь актин утаснуудыг тасалдуулж байгааг ажигласан.50 μM эсвэл 100 μM KAND 11-тэй 1 цагийн турш эмчилгээ хийснээр актин судлын нягтыг 1.20 ± 0.62% буюу 0.61 ± 0.26% болгон мэдэгдэхүйц бууруулсан бол DMSO-тай эмчилсэн эсийн нягтрал 1.69 ± 2% (Fi.51 ± 2%) байв.7б).Эдгээр үр дүн нь актин утаснуудад нөлөөлдөггүй пропизамид ба микротубулд нөлөөлдөггүй актин деполимеризатор болох латрункулин В-ийн нөлөөнөөс ялгаатай (SI Зураг S6).Нэмж дурдахад, кумамонамид 1, кумамонамидын хүчил 6 эсвэл KAND 11-тэй эмчилгээ нь HeLa эсийн микротубулуудад нөлөөлөөгүй (SI Зураг S7).Тиймээс KAND 11-ийн үйл ажиллагааны механизм нь мэдэгдэж буй эсийн араг ясыг тасалдагчаас ялгаатай гэж үздэг.Нэмж дурдахад KAND 11-ээр эмчилсэн BY-2 эсийн микроскопоор хийсэн бидний судалгаагаар KAND 11-ийн эмчилгээний явцад эсийн үхэл эхэлснийг илрүүлсэн бөгөөд KAND 11 эмчилгээний 30 минутын дараа Эванс хөхөөр будсан үхсэн эсийн эзлэх хувь төдийлөн нэмэгдээгүй болохыг харуулсан. 50 μM буюу 100 μM KAND-тай 90 минутын эмчилгээ хийсний дараа үхсэн эсийн тоо 43.7% буюу 80.1% болж өссөн байна (Зураг 7c).Эдгээр өгөгдлүүдийг нэгтгэн үзвэл шинэ урсолын хүчлийн дериватив KAND 11 нь үйл ажиллагааны механизм нь тодорхойгүй байсан ургамлын өвөрмөц эсийн ясны дарангуйлагч болохыг харуулж байна.
KAND нь кортикал бичил гуурсан хоолой, актин утас, тамхины BY-2 эсийн амьдрах чадварт нөлөөлдөг.(a) TagRFP-TUA6 байгаа үед BY-2 эсүүд дэх кортикал микротубулуудыг дүрслэх.KAND 11 (50 μM эсвэл 100 μM) эсвэл DMSO-ээр эмчилсэн BY-2 эсийг конфокаль микроскопоор шалгасан.Кортикал бичил гуурсан хоолойн нягтыг 25 бие даасан эсийн микрографиас тооцоолсон.Үсэг нь мэдэгдэхүйц ялгааг илэрхийлдэг (Тукей HSD тест, х< 0.05).Хуваарийн мөр = 10 микрон.(б) BY-2 эсүүд дэх кортикал актин утаснууд нь GFP-ABD2 байгаа нөхцөлд дүрслэгдсэн байдаг.KAND 11 (50 μM эсвэл 100 μM) эсвэл DMSO-ээр эмчилсэн BY-2 эсийг конфокаль микроскопоор шалгасан.Кортикал актин утаснуудын нягтыг 25 бие даасан эсийн микрографиас тооцоолсон.Үсэг нь мэдэгдэхүйц ялгааг илэрхийлдэг (Тукей HSD тест, х< 0.05).Хуваарийн мөр = 10 микрон.(в) Эвансын хөх будгаар үхсэн BY-2 эсийг ажиглах.KAND 11 (50 μM эсвэл 100 μM) эсвэл DMSO-ээр эмчилсэн BY-2 эсийг тод талбайн микроскопоор шалгасан.n=3.Хуваарийн мөр = 100 мкм.
Байгалийн гаралтай шинэ бүтээгдэхүүнийг нээж, хэрэглэх нь хүний амьдралын янз бүрийн салбарт, тэр дундаа анагаах ухаан, хөдөө аж ахуйд ихээхэн ахиц дэвшил гаргахад хүргэсэн.Байгалийн баялгаас ашигтай нэгдлүүдийг гаргаж авах түүхийн судалгаа хийгдсэн.Ялангуяа, актиномицетууд нь эмэнд хорт хавдрын эсрэг бодис болгон ашигладаг авермектин, блеомицин болон түүний деривативуудын хар тугалганы нэгдэл болох авермектин гэх мэт янз бүрийн хоёрдогч метаболит үүсгэх чадвартай тул нематодуудад шимэгч хорхойн эсрэг антибиотик болох нь мэдэгдэж байна21,22.Үүний нэгэн адил актиномицетуудаас олон төрлийн гербицид нэгдлүүд илэрсэн бөгөөд тэдгээрийн заримыг нь аль хэдийн худалдаанд ашиглаж байна1,23.Тиймээс хүссэн биологийн идэвхжил бүхий байгалийн гаралтай бүтээгдэхүүнийг тусгаарлахын тулд актиномицетын метаболитуудын шинжилгээг үр дүнтэй стратеги гэж үздэг.Энэ судалгаагаар бид S. werraensis-ээс куумонамид хэмээх шинэ нэгдлийг олж, амжилттай нийлэгжүүлсэн.Урсоны хүчил нь урбенамид ба түүний деривативуудын нийлэг завсрын бүтээгдэхүүн юм.Энэ нь өвөрмөц үндэс буржгар үүсгэж, дунд болон хүчтэй гербицидийн үйл ажиллагаа явуулж, ургамлын микротубулыг шууд болон шууд бусаар гэмтээж болно.Гэсэн хэдий ч урмотоник хүчлийн үйл ажиллагааны механизм нь одоо байгаа бичил гуурсан хоолойн дарангуйлагчдаас ялгаатай байж болно, учир нь KAND 11 нь мөн актин утаснуудыг тасалдуулж, эсийн үхэлд хүргэдэг бөгөөд энэ нь урмотоник хүчил ба түүний деривативууд нь эсийн араг ясны өргөн хүрээний бүтцэд нөлөөлдөг зохицуулалтын механизмыг харуулж байна..
Урбеноны хүчлийн цаашдын нарийвчилсан шинж чанар нь урбеноны хүчлийн үйл ажиллагааны механизмыг илүү сайн ойлгоход тусална.Ялангуяа дараагийн зорилго нь урсоны хүчил болон түүний деривативууд бичил гуурсан хоолойд шууд үйлчилж, тэдгээрийг деполимержүүлж байгаа эсэх, эсхүл тэдгээрийн үйл ажиллагааны үр дүнд бичил гуурсан хоолойн тогтворгүй байдалд хүргэдэг эсэхийг тодорхойлохын тулд урсоны хүчлийн багассан бичил гуурсан хоолойтой холбогдох чадварыг үнэлэх явдал юм.Нэмж дурдахад, микротубулууд нь шууд зорилтот биш тохиолдолд ургамлын эсүүд дээр урсоны хүчлийн үйл ажиллагааны газар ба молекулын зорилтуудыг тодорхойлох нь холбогдох нэгдлүүдийн шинж чанар, гербицидийн үйл ажиллагааг сайжруулах боломжит аргуудыг ойлгоход тусална.Бидний био идэвхжилийн шинжилгээгээр Арабидопсис thaliana, тамхи, элэгний ургамал зэрэг ургамлын ургалтад урсоны хүчлийн өвөрмөц цитотоксик чадварыг илрүүлсэн бол E. coli болон HeLa эсийн аль нь ч өртөөгүй.Урсоны хүчлийн деривативыг хөдөө аж ахуйн ил талбайд ашиглах зорилгоор гербицид болгон боловсруулсан бол амьтны эсэд хор багатай эсвэл огт байхгүй нь давуу тал юм.Үнэн хэрэгтээ микротубулууд нь эукариотуудын нийтлэг бүтэц байдаг тул тэдгээрийг ургамалд сонгон дарангуйлах нь гербицидийн гол шаардлага юм.Тухайлбал, тубулинтай шууд холбогддог, полимержилтийг дарангуйлдаг микротубулын деполимержүүлэгч пропизамид нь амьтны эсэд бага хоруу чанартай тул гербицид болгон ашигладаг24.Дизопирамидаас ялгаатай нь холбогдох бензамидууд нь өөр өөр зорилтот онцлогтой байдаг.Ургамлын бичил гуурсан хоолойноос гадна RH-4032 буюу бензоксамид нь амьтны эс эсвэл оомицетын микротубулуудыг дарангуйлдаг ба залиламид нь фитотоксик чанар багатай тул фунгицид болгон ашигладаг25,26,27.Шинээр олдсон баавгай болон түүний деривативууд нь ургамлын эсрэг сонгомол цитотоксик шинж чанартай байдаг ч цаашдын өөрчлөлтүүд нь тэдний зорилтот өвөрмөц байдлыг өөрчилж, эмгэг төрүүлэгч мөөгөнцөр эсвэл омицетын эсрэг нэмэлт деривативуудыг бий болгож болзошгүйг тэмдэглэх нь зүйтэй.
Урбеноны хүчил ба түүний деривативуудын өвөрмөц шинж чанарууд нь тэдгээрийг гербицид болгон боловсруулж, судалгааны хэрэгсэл болгон ашиглахад тустай.Ургамлын эсийн хэлбэрийг хянахад цитоскелетоны ач холбогдлыг олон нийт хүлээн зөвшөөрдөг.Ургамал нь морфогенезийг зөв хянахын тулд бичил гуурсан хоолойн динамикийг хянах замаар кортикал бичил гуурсан хоолойн зохион байгуулалтын нарийн төвөгтэй механизмыг хөгжүүлсэн болохыг өмнөх судалгаанууд харуулсан.Бичил гуурсан хоолойн үйл ажиллагааг зохицуулах үүрэгтэй олон тооны молекулууд тогтоогдсон бөгөөд холбогдох судалгаанууд үргэлжилсээр байна3,4,28.Ургамлын эс дэх микротубулын динамикийн талаарх бидний одоогийн ойлголт нь кортикал микротубулын зохион байгуулалтын механизмыг бүрэн тайлбарлаж чадахгүй байна.Жишээлбэл, дизопирамид ба оризалин хоёулаа бичил гуурсан хоолойг деполимержүүлж чаддаг ч дизопирамид нь үндсийг хүчтэй гажуудуулдаг бол оризалин нь харьцангуй зөөлөн нөлөө үзүүлдэг.Түүнчлэн микротубулыг тогтворжуулдаг тубулины мутаци нь үндэст декстроротаци үүсгэдэг бол микротубулын динамикийг тогтворжуулдаг паклитаксел нь тийм биш юм.Тиймээс урсолик хүчлийн молекулын зорилтуудыг судалж, тодорхойлох нь ургамлын кортикал бичил гуурсан хоолойн зохицуулалтын талаархи шинэ ойлголтыг өгөх ёстой.Үүний нэгэн адил, дизопирамид зэрэг гажуудсан өсөлтийг дэмжих үр дүнтэй химийн бодис болон оризалин эсвэл кумамоторын хүчил зэрэг үр дүн багатай химийн бодисуудыг ирээдүйн харьцуулалт нь гажуудсан өсөлтийг хэрхэн бий болгох талаар ойлголт өгөх болно.
Нөгөөтэйгүүр, хамгаалалттай холбоотой эсийн араг ясны бүтцийн өөрчлөлт нь урсоны хүчлийн эсийн хоруу чанарыг тайлбарлах өөр нэг боломж юм.Өвчин үүсгэгчийг халдварлах эсвэл ургамлын эсэд үүсгэгч бодис нэвтрүүлэх нь заримдаа эсийн араг ясыг устгаж, улмаар эсийн үхэлд хүргэдэг29.Жишээлбэл, оомицетын гаралтай криптоксантин нь тамхины эсийг үхэхээс өмнө микротубул болон актин судалтай хэсгийг тасалдуулж, KAND эмчилгээнд тохиолддогтой төстэй гэж мэдээлсэн байна30,31.Урсоны хүчлээр өдөөгдсөн хамгаалалтын хариу урвал ба эсийн хариу урвалын ижил төстэй байдал нь урсоны хүчлийн криптоксантинаас илүү хурдан бөгөөд хүчтэй нөлөө үзүүлдэг боловч эдгээр нь эсийн нийтлэг процессыг өдөөдөг гэсэн таамаглалыг бидэнд хүргэсэн.Гэсэн хэдий ч актин утаснуудын тасалдал нь эсийн аяндаа үхэлд хүргэдэг болохыг судалгаагаар тогтоосон бөгөөд энэ нь үргэлж бичил гуурсан хоолойн тасалдал дагалддаггүй29.Нэмж дурдахад эмгэг төрүүлэгч эсвэл үүсгэгч нь урсоны хүчлийн деривативын нэгэн адил гажигтай үндэс ургалтыг үүсгэдэг эсэхийг харах хэвээр байна.Тиймээс хамгаалалтын хариу урвал ба эсийн араг ясыг холбосон молекулын мэдлэг нь шийдвэрлэх шаардлагатай асуудал юм.Урсоны хүчилтэй холбоотой бага молекул жинтэй нэгдлүүд, түүнчлэн янз бүрийн хүчин чадалтай олон төрлийн деривативуудыг ашигласнаар тэдгээр нь үл мэдэгдэх эсийн механизмыг чиглүүлэх боломжийг олгодог.
Хамтдаа авч үзвэл бичил гуурсан хоолойн динамикийг зохицуулдаг шинэ нэгдлүүдийг нээж, хэрэглэх нь ургамлын эсийн хэлбэрийг тодорхойлох үндсэн молекулын цогц механизмыг шийдвэрлэх хүчирхэг аргуудыг өгөх болно.Энэ утгаараа бичил гуурсан хоолой ба актин утаснуудад нөлөөлж, эсийн үхлийг өдөөдөг саяхан бүтээгдсэн урмотоник хүчил нь микротубулын хяналт болон бусад механизмуудын хоорондын холбоог тайлах боломжийг олгож магадгүй юм.Тиймээс урбеноны хүчил ашиглан химийн болон биологийн шинжилгээ хийх нь ургамлын эсийн араг ясыг хянадаг молекулын зохицуулалтын механизмыг ойлгоход тусална.
S. werraensis MK493-CF1-ийг 2% (w/v) галактоз, 2% (w/v) эссенц зуурмаг, 1% (w/v) Bacto найрлага агуулсан 110 мл үрийн тэжээл агуулсан 500 мл-ийн бүдгэрсэн эрлэнгүй колбонд тарина. .-сойтон (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) эрдэнэ шишийн ханд (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4, 0.2% CaCO3 ионгүйжүүлсэн усанд.(ариутгахаас өмнө рН 7.4).Үрийн өсгөвөрийг эргэдэг сэгсрэгч (180 эрг/мин) дээр 2 хоногийн турш 27°С-т өсгөвөрлөнө.Хатуу төлөвт исгэх замаар үйлдвэрлэлийн тариалалт.Үрийн өсгөвөрийг (7 мл) 15 г дарсан арвай (МУСО ХХК, Япон) болон 25 г ионгүйжүүлсэн ус (рН тохируулаагүй) агуулсан 40 г үйлдвэрлэлийн тэжээл бүхий 500 мл K-1 колбонд хийнэ. ариутгахаас өмнө).).Исгэлтийг 30 градусын температурт харанхуй газар 14 хоногийн турш явуулна.Исгэх материалыг 40 мл/лонх EtOH-ээр гаргаж аваад центрифуг хийсэн (1500 гр, 4°С, 10 минут).Өсгөвөрлөгчийн дээд давхаргыг (60 мл) 10% MeOH/EtOAc-ийн хольцоор гаргаж авсан.Органик давхаргыг бууруулсан даралтын дор ууршуулж үлдэгдэл (59.5 мг) гаргаж, түүнийг урвуу фазын баганад (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 мкм, ID) градиент уусмалаар (0-10 минут: 90%) HPLC-д хамруулсан. 10 мм × урт 250 мм) H2O/CH3CN, 10–35 минут: 90% H2O/CH3CN - 70% H2O/CH3CN (градиент), 35–45 минут: 90% H2O/EtOH, 45–155 минут: 90% H2O /EtOH-аас 100% EtOH (градиент (градиент), 155-200 мин: 100% EtOH) 1.5 мл/мин урсгалын хурдаар куумамонамид (1, 36.0 мг) цагаан аморф нунтаг хэлбэрээр тусгаарлагдсан.
Кумамотоамид(1);1H-NMR (500 МГц, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Гц, 1Н), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Гц 1Н), 6.05 (t, J = 3.8 Гц, 1Н).), 4.08 (с, 3H);13C-NMR (125 МГц, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ тооцоолсон утга: 141.0659, хэмжсэн утга: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593–113 см.
Колумбийн үрийг (Кол-0) Арабидопсисын Биологийн Нөөцийн Төвөөс (ABRC) судалгаанд ашиглах зөвшөөрөлтэйгээр авсан.Кол-0 үрийг манай лабораторийн нөхцөлд үржүүлж, арчилж, зэрлэг Арабидопсисын ургамал болгон ашигласан.Арабидопсисын үрийг гадаргууг ариутгаж, 2% сахароз (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-морфолино)этансульфоны хүчил (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) агуулсан хагас бат бөх Мурашиг ба Скоог орчинд өсгөвөрлөв. ).) ба 1.5% агар (Fujifilm Wako Pure Chemical), рН 5.7, 23 ° C, байнгын гэрэлтэй.Phs1-1 мутант үрийг Т.Хашимото (Нарагийн Шинжлэх ухаан, технологийн хүрээлэн) гаргажээ.
SR-1 омгийн үрийг Т.Хашимото (Нара Шинжлэх ухаан технологийн хүрээлэн) гаргаж, зэрлэг тамхины ургамал болгон ашигласан.Тамхины үрийг гадаргууг ариутгаж, соёололтыг дэмжихийн тулд гурван шөнийн турш ариутгасан усанд дэвтээж, дараа нь 2% сахароз, 0.05% (w/v) MES, 0.8% геллан бохь (Fujifilm Wako Pure Chemical) агуулсан хагас бат бэх уусмалд хийнэ. Мурашигэ.болон Skoog орчин) рН 5.7, байнгын гэрэлд 23°С-т өсгөвөрлөнө.
Так-1 омгийг Т.Кохчи (Киотогийн их сургууль) гаргаж өгсөн бөгөөд элэгний ургамлын судалгааны стандарт туршилтын нэгж болгон ашигласан.Ариутгасан өсгөвөрлөгч ургамлаас гемма гарган авч, дараа нь 1% сахароз, 0.3% геллан бохь агуулсан Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) орчинд бүрж, 23°С-т тасралтгүй гэрэлд өсгөвөрлөв.
Тамхины BY-2 эсийг (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) С.Хасезава (Токиогийн их сургууль) гаргаж өгсөн.BY-2 эсийг өөрчилсөн Linsmeier болон Skoog орчинд 95 дахин шингэлж, долоо хоног бүр 2,4-дихлорфеноксицууны хүчил 32-аар нэмэгдүүлсэн.Эсийн суспензийг эргэдэг сэгсрэгч дээр 130 эрг/мин-д 27°С-т харанхуйд хольсон.10 дахин их хэмжээний шинэхэн тэжээлээр эсийг угааж, ижил орчинд дахин түдгэлзүүлнэ.Цэцэгт байцааны мозайк вирус 35S дэмжигчийн дор TagRFP-TUA6 бичил гуурсан тэмдэг эсвэл актин судалтай маркер GFP-ABD2-ийг тогтвортой илэрхийлэх BY-2 трансген эсийн шугамыг тайлбарласны дагуу үүсгэсэн.33,34,35.Эдгээр эсийн шугамыг анхны BY-2 эсийн шугамд ашигладагтай төстэй процедурыг ашиглан хадгалж, синхрончилж болно.
HeLa эсүүдийг Dulbecco-ийн өөрчилсөн Eagle's ortam (DMEM) (Life Technologies)-д 10%-ийн ургийн үхрийн ийлдэс, 1.2 U/мл пенициллин, 1.2 мкг/мл стрептомицин агуулсан 37°С-т 5%-ийн CO2-тай инкубаторт өсгөвөрлөв.
Энэхүү гар бичмэлд дурдсан бүх туршилтыг Японы биоаюулгүй байдлын дүрэм, зааврын дагуу хийсэн.
Нэгдлүүдийг диметил сульфоксид (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) уусмал хэлбэрээр уусгаж, Арабидопсис ба тамхины MS тэжээлт орчинд эсвэл элэгний ургамлын Gamborg B5 орчинд шингэлсэн.Үндэс ургалтыг дарангуйлах шинжилгээнд заасан нэгдлүүд эсвэл DMSO агуулсан агар орчинд нэг хавтан дээр 10 гаруй үр тариалсан.Үрийг 7 хоногийн турш өсөлтийн камерт өсгөвөрлөнө.Суулгацын зургийг авч, үндэсийн уртыг хэмжсэн.Arabidopsis-ийн соёололтыг тодорхойлохын тулд 200 мкМ нэгдэл буюу DMSO агуулсан агар орчинд нэг хавтан дээр 48 үр тариалсан.Арабидопсисын үрийг ургалтын камерт ургуулж, соёололтоос (даг) 7 хоногийн дараа соёолсон суулгацын тоог тоолсон.Тамхины соёололтыг тодорхойлохын тулд 200 μM KAND эсвэл DMSO агуулсан агар орчинд нэг хавтан дээр 24 үр тариалсан.Тамхины үрийг ургалтын камерт ургуулж, 14 хоногийн дараа соёолсон суулгацын тоог тоолсон.Элэгний ургамлын өсөлтийг дарангуйлах шинжилгээнд хавтан тус бүрээс 9 үр хөврөлийг заасан KAND эсвэл DMSO концентрацийг агуулсан агар орчинд тавиад өсөлтийн камерт 14 хоногийн турш өсгөвөрлөсөн.
Үндэс меристемийн зохион байгуулалтыг дүрслэхийн тулд 5 мг/мл пропидиум иодид (PI) -аар будсан суулгацыг ашиглана.PI дохиог TCS SPE конфокаль лазер сканнерийн микроскоп (Leica Microsystems) ашиглан флюресцент микроскопоор ажиглав.
Үндэсийг β-глюкуронидаза (GUS) -аар гистохимийн будгийг Малами, Бенфей нарын тодорхойлсон протоколын дагуу хийсэн36.Суулгацыг 90%-ийн ацетонд хонуулж, 0.5 мг/мл 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-д-глюкуроны хүчлээр GUS буферт 1 цагийн турш будаж, хлоральдегидийн гидрат уусмалд хийнэ.(8 г хлорын гидрат, 2 мл ус, 1 мл глицерин) ба Axio Imager M1 микроскоп (Карл Зейсс) ашиглан дифференциал интерференцийн тодосгогч бичил харуураар ажиглав.
Босоо байрлуулсан хавтан дээр ургасан 7 хоногийн настай суулгац дээр үндэс өнцгийг хэмжсэн.6-р алхамд тайлбарласны дагуу таталцлын векторын чиглэлээс үндэсийн өнцгийг хэмжинэ.
Кортикал бичил гуурсан хоолойн зохион байгуулалтыг тайлбарласны дагуу 37-р протоколд бага зэрэг өөрчлөлт оруулан ажиглав.Анти-тубулины эсрэгбие (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) болон Alexa Fluor 488-тэй холбосон хулганы эсрэг IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) нь анхдагч ба хоёрдогч эсрэгбие болгон 1:1000 ба 1:10 шингэрүүлэлтээр ашигласан. тус тус.Флюресценцийн зургийг TCS SPE конфокаль лазер сканнерийн микроскоп (Leica Microsystems) ашиглан авсан.Z-стекийн зургийг авч, үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу хамгийн их эрчимтэй төсөөлөл үүсгэх.
HeLa эсийн өсөлтийн шинжилгээг үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу Cell Counting Kit 8 (Dojindo) ашиглан хийсэн.
E. coli DH5α-ийн өсөлтийг 600 нм (OD600)-д спектрофотометр ашиглан өсгөвөрт эсийн нягтыг хэмжих замаар шинжилэв.
Трансген BY-2 эс дэх эсийн араг ясны зохион байгуулалтыг CSU-X1 төвлөрсөн сканнерын төхөөрөмж (Ёкогава) болон sCMOS камер (Zyla, Andor Technology) -ээр тоноглогдсон флюресцент микроскоп ашиглан ажиглав.Эсийн араг ясны нягтыг дүрсний шинжилгээгээр үнэлж, тодорхойлсны дагуу ImageJ программ хангамжийг ашиглан конфокаль зураг дээрх цитоплазмын пикселийн хоорондох эсийн араг ясны пикселийн хувийн жинг тодорхойлсон болно38,39.
BY-2 эсийн эсийн үхлийг илрүүлэхийн тулд эсийн суспензийн нэг хэсгийг тасалгааны температурт 0.05% Эванс хөхөөр 10 минутын турш өсгөвөрлөсөн.Үхсэн эсийг Эвансын цэнхэр өнгөөр будах нь плазмын мембраны бүрэн бүтэн эсээс будгийг гадагшлуулахаас хамаарна40.Толботой эсийг тод талбайн микроскоп (BX53, Olympus) ашиглан ажиглав.
HeLa эсийг DMEM-д 10% FBS-ээр дүүргэсэн 37 ° C, 5% CO2 чийгшүүлсэн инкубаторт ургуулсан.Эсийг 100 мкМ КАНД 11, кумамонамины хүчил 6, кумамонамид 1, 100 нг/мл кольцемид (Гибко) эсвэл 100 нг/мл Nocodmaze (Sigma) -аар 37 хэмд 6 цагийн турш эмчилсэн.Эсүүдийг MetOH-ээр 10 минутын турш, дараа нь ацетатаар 5 минутын турш тасалгааны температурт бэхэлсэн.Тогтмол эсүүдийг β-тубулин анхдагч эсрэгбие (1D4A4, Proteintech: 66240-1) 0.5% BSA/PBS-т шингэлж 2 цагийн турш өсгөвөрлөж, TBST-ээр 3 удаа угааж, дараа нь Alexa Fluor ямааны эсрэгбиемээр өсгөвөрлөсөн.488 1 цаг.– Хулганы IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) ба 15 нг/мл 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) 0.5% BSA/PBS-д шингэлнэ.TBST-ээр гурван удаа угаасны дараа будсан эсүүдийг Nikon Eclipse Ti-E урвуу микроскопоор ажиглав.Зургийг MetaMorph программ (Молекулын төхөөрөмж) ашиглан хөргөсөн Hamamatsu ORCA-R2 CCD камераар авсан.
Шуудангийн цаг: 2024 оны 6-р сарын 17