Найлзууруудын оройн меристем (SAM) өсөлт нь ишний архитектурт чухал үүрэгтэй. Ургамлын гормонуудгиббереллин(ГБ) ургамлын өсөлтийг зохицуулахад гол үүрэг гүйцэтгэдэг боловч SAM-д гүйцэтгэх үүрэг нь сайн ойлгогдоогүй хэвээр байна. Энд бид DELLA уургийн GA транскрипцийн хариу урвалын үндсэн зохицуулалтын функцийг дарангуйлахын зэрэгцээ GA-г хүлээн зөвшөөрөх үед түүний доройтлыг хадгалахын тулд инженерчлэлийн аргаар GA дохиоллын харьцаа хэмжигч био мэдрэгчийг боловсруулсан. Энэхүү доройтолд суурилсан биосенсор нь хөгжлийн явцад GA түвшин болон эсийн мэдрэгч дэх өөрчлөлтийг үнэн зөв бүртгэдэг болохыг бид харуулж байна. Бид энэ био мэдрэгчийг SAM дахь GA дохионы үйл ажиллагааг зураглахад ашигласан. Өндөр GA дохио нь голчлон зангилаа хоорондын эсүүдийн урьдал эрхтнүүдийн хооронд байрлах эсүүдэд байдгийг бид харуулж байна. Функцийг нэмэгдүүлэх, алдах аргуудыг ашиглан бид GA нь эсийн хуваагдлын хавтгайн чиг баримжааг зохицуулж, завсрын эсийн каноник зохион байгуулалтыг бий болгож, улмаар SAM дахь зангилаа хоорондын тодорхойлолтыг дэмждэг болохыг харуулж байна.
Найлзууруудын оройд байрлах найлзуурын оройн меристем (SAM) нь ургамлын амьдралын туршид модульчлагдсан, давтагдах байдлаар хажуугийн эрхтнүүд болон ишний зангилааг үүсгэдэг үүдэл эсийн үүрийг агуулдаг. Эдгээр давтагдах нэгж буюу ургамлын зангилаа бүр нь зангилааны завсрын болон хажуугийн эрхтнүүд, навчны суганы суганы меристемийг агуулдаг1. Ургамлын зангилааны өсөлт, зохион байгуулалт нь хөгжлийн явцад өөрчлөгддөг. Арабидопсисын хувьд ургамлын үе шатанд зангилаа хоорондын өсөлт дарагдаж, суганы меристем нь сарнайн навчны суганд унтаа хэвээр байна. Цэцгийн үе рүү шилжих үед САМ нь баг цэцэгтэй меристем болж, сунасан зангилаа ба суганы нахиа, каулин навчны суганд мөчир, дараа нь навчгүй цэцэг үүсгэдэг2. Хэдийгээр бид навч, цэцэг, мөчрүүдийн эхлэлийг хянадаг механизмыг ойлгоход ихээхэн ахиц дэвшил гаргасан ч завсрын зангилаа хэрхэн үүсдэг талаар харьцангуй бага мэддэг.
GA-ийн орон зайн цаг хугацааны тархалтыг ойлгох нь эдгээр дааврын янз бүрийн эд эс, хөгжлийн янз бүрийн үе шатанд үйл ажиллагааг илүү сайн ойлгоход тусална. RGA-GFP хайлуулах задралыг өөрийн дэмжигчийн үйл ажиллагааны дор харуулсан дүрслэл нь үндэс дэх нийт GA түвшинг зохицуулах чухал мэдээллийг өгдөг15,16. Гэсэн хэдий ч RGA илэрхийлэл нь эд эсэд харилцан адилгүй байдаг17 бөгөөд GA18-ээр зохицуулагддаг. Тиймээс RGA дэмжигчийн дифференциал илэрхийлэл нь RGA-GFP-д ажиглагдсан флюресценцийн загварт хүргэж болзошгүй тул энэ арга нь тоон биш юм. Саяхан биоидэвхтэй флуоресцеин (Fl) шошготой GA19,20 нь GA-ийн үндсэн дотоод кортекст хуримтлагдаж, эсийн түвшинг GA тээвэрлэлтээр зохицуулж байгааг илрүүлсэн. Саяхан GA FRET мэдрэгч nlsGPS1 нь GA-ийн түвшин нь үндэс, утас, харанхуй ургасан гипокотилуудын эсийн суналттай хамааралтай болохыг харуулсан21. Гэсэн хэдий ч бидний харж байгаагаар GA концентраци нь нарийн төвөгтэй мэдрэх процессоос хамаардаг тул GA дохиоллын үйл ажиллагааг хянадаг цорын ганц параметр биш юм. Энд бид DELLA болон GA дохиоллын замуудын талаарх бидний ойлголтыг үндэслэн GA дохиоллын доройтолд суурилсан харьцаа хэмжигч био мэдрэгчийг боловсруулж, шинж чанарыг илтгэж байна. Энэхүү тоон биосенсорыг хөгжүүлэхийн тулд бид флюресцент уурагтай ууссан, эд эсэд хаа сайгүй илэрхийлэгддэг мутант GA-мэдрэмтгий RGA, мөн GA мэдрэмтгий биш флюресцент уураг ашигласан. Мутантын RGA уургийн нэгдэл нь хаа сайгүй илэрхийлэгдэх үед эндоген GA дохиололд саад учруулдаггүй бөгөөд энэхүү биосенсор нь орон зайн өндөр нарийвчлалтай мэдрэгч төхөөрөмжөөр GA оролт болон GA дохионы боловсруулалтаас үүсэх дохионы үйл ажиллагааг тоолж чаддаг болохыг бид харуулж байна. Бид энэхүү био мэдрэгчийг ашиглан GA дохионы үйл ажиллагааны орон зайн цаг хугацааны тархалтыг зураглаж, GA нь SAM эпидермисийн эсийн үйл ажиллагааг хэрхэн зохицуулж байгааг тооцоолоход ашигласан. GA нь эрхтнүүдийн анхдагч хэсгүүдийн хооронд байрлах SAM эсийн хуваагдлын хавтгайн чиглэлийг зохицуулж, улмаар завсрын эсийн каноник зохион байгуулалтыг тодорхойлдог болохыг бид харуулж байна.
Эцэст нь бид qmRGA нь өсөн нэмэгдэж буй гипокотилуудыг ашиглан эндоген GA түвшний өөрчлөлтийг мэдээлэх боломжтой эсэхийг асуув. Нитрат нь GA синтезийг нэмэгдүүлж, улмаар DELLA34-ийн задралыг нэмэгдүүлснээр өсөлтийг өдөөдөг болохыг бид өмнө нь харуулсан. Үүний дагуу нитрат их хэмжээгээр (10 мМ NO3−) ургуулсан pUBQ10::qmRGA суулгац дахь гипокотилын урт нь нитрат дутагдалтай нөхцөлд ургасан суулгацынхаас хамаагүй урт болохыг бид ажигласан (Нэмэлт зураг 6a). Өсөлтийн хариу урвалтай нийцүүлэн GA дохио нь нитрат байхгүй үед ургуулсан суулгацаас 10 мМ NO3− нөхцөлд ургасан суулгацын гипокотилуудад өндөр байв (Нэмэлт Зураг 6b, c). Тиймээс qmRGA нь GA концентрацийн эндоген өөрчлөлтөөс үүдэлтэй GA дохиоллын өөрчлөлтийг хянах боломжийг олгодог.
QmRGA-ээр илрүүлсэн GA дохионы үйл ажиллагаа нь мэдрэгчийн загварт үндэслэн хүлээгдэж буй GA концентраци болон GA ойлголтоос хамаардаг эсэхийг ойлгохын тулд бид ургамлын болон нөхөн үржихүйн эдэд гурван GID1 рецепторын илэрхийлэлд дүн шинжилгээ хийсэн. Суулгацанд GID1-GUS сурвалжлагч шугам нь GID1a ба c нь котиледонд их хэмжээгээр илэрхийлэгддэг болохыг харуулсан (Зураг 3a-c). Үүнээс гадна бүх гурван рецепторыг навч, хажуугийн үндэс primordia, үндэс үзүүр (GID1b-ийн эх малгайгаас бусад), судасны систем (Зураг 3a-c) -ээр илэрхийлсэн. Цэцгийн SAM-д бид зөвхөн GID1b ба 1c-ийн GUS дохиог илрүүлсэн (Нэмэлт зураг 7a-c). In situ эрлийзжүүлэлт нь эдгээр илэрхийллийн хэв маягийг баталж, GID1c нь SAM-ийн бага түвшинд жигд илэрхийлэгддэгийг харуулсан бол GID1b нь SAM-ийн захад илүү их илэрхийлэлийг харуулсан (Нэмэлт зураг 7d-l). pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b орчуулгын нэгдэл нь мөн GID1b илэрхийллийн зэрэглэлийг илрүүлсэн бөгөөд SAM-ийн төвд бага эсвэл огт илэрхийлэгдэхгүй, эрхтний хил дээрх өндөр илэрхийлэл хүртэл (Нэмэлт зураг 7м). Тиймээс GID1 рецепторууд нь эд эсийн дотор болон дотор жигд тархдаггүй. Дараагийн туршилтуудад бид GID1 (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) хэт их илэрхийлэл нь гипокотил дахь qmRGA-ийн гадны GA хэрэглээнд мэдрэмтгий байдлыг нэмэгдүүлж байгааг ажигласан (Зураг 3d, e). Үүний эсрэгээр, гипокотил дахь qd17mRGA-ээр хэмжсэн флюресцент нь GA3 эмчилгээнд мэдрэмтгий биш байсан (Зураг 3f, g). Хоёр шинжилгээний хувьд суулгацыг өндөр концентрацитай GA (100 μM GA3) -аар эмчилж, мэдрэгчийн хурдацтай үйлдлийг үнэлэхийн тулд GID1 рецептортой холбогдох чадвар сайжирсан эсвэл алдагдсан байна. Эдгээр үр дүн нь qmRGA биосенсор нь GA болон GA мэдрэгчийн хосолсон функцийг гүйцэтгэдэг болохыг баталж, GID1 рецепторын дифференциал илэрхийлэл нь мэдрэгчийн ялгаралтыг ихээхэн өөрчилж чадна гэдгийг харуулж байна.
Өнөөдрийг хүртэл SAM дахь GA дохионы тархалт тодорхойгүй хэвээр байна. Тиймээс бид L1 давхаргад (эпидерми; Зураг 4a, b, Арга, нэмэлт аргуудыг үзнэ үү) анхаарлаа хандуулж, GA дохиоллын үйл ажиллагааны өндөр нарийвчлалтай тоон зураглалыг тооцоолохдоо qmRGA илэрхийлэгч ургамал болон pCLV3::mCherry-NLS үүдэл эсийн сурвалжлагч35-ийг ашигласан. Энд pCLV3::mCherry-NLS илэрхийлэл нь GA дохионы үйл ажиллагааны орон зайн цаг хугацааны тархалтыг шинжлэхэд зориулсан тогтмол геометрийн лавлах цэгийг өгсөн37. Хэдийгээр GA нь хажуугийн эрхтнүүдийн хөгжилд зайлшгүй шаардлагатай гэж үздэг4 боловч Р3 үе шатаас эхлэн цэцгийн анхдагч (P) -д GA дохио бага байгааг ажигласан (Зураг 4a, b), харин залуу P1 ба P2 анхдагч нь төвийн бүсийнхтэй төстэй дунд зэргийн идэвхжилтэй байсан (Зураг 4a, b). Дээд GA дохионы идэвхжил нь эрхтнүүдийн анхдагч хэсгийн хил дээр, P1/P2-ээс (хилийн хажуугаар) эхэлж, P4-т дээд цэгтээ хүрдэг, мөн primordia хооронд байрлах захын бүсийн бүх эсүүдэд илэрсэн (Зураг 4a, b ба Нэмэлт зураг 8a, b). Энэхүү өндөр GA дохионы идэвхжил нь эпидермисийн төдийгүй L2 ба L3 дээд давхаргад ажиглагдсан (Нэмэлт зураг 8b). QmRGA ашиглан SAM-д илрүүлсэн GA дохионы загвар нь цаг хугацааны явцад өөрчлөгдөөгүй хэвээр байв (Нэмэлт зураг 8c-f, k). Хэдийгээр qd17mRGA бүтцийг бидний нарийвчлан тодорхойлсон бие даасан таван шугамаас T3 ургамлын SAM-д системтэйгээр бууруулсан ч бид pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP бүтцээр олж авсан флюресценцийн хэв маягт дүн шинжилгээ хийж чадсан (Нэмэлт зураг 8g–j, l). Энэхүү хяналтын шугамд зөвхөн флюресценцийн харьцааны бага зэргийн өөрчлөлтийг SAM-д илрүүлсэн боловч SAM төвд бид TagBFP-тэй холбоотой VENUS-ийн тодорхой бөгөөд гэнэтийн бууралтыг ажигласан. Энэ нь qmRGA-ийн ажигласан дохионы загвар нь mRGA-VENUS-ийн GA-аас хамааралтай доройтлыг тусгаж байгааг баталж байгаа боловч qmRGA нь меристемийн төвд GA дохионы үйл ажиллагааг хэт үнэлж болохыг харуулж байна. Дүгнэж хэлэхэд, бидний үр дүн нь үндсэндээ примордиагийн тархалтыг тусгасан GA дохионы загварыг харуулж байна. Анхдагч үе хоорондын бүсийн (IPR) ийм тархалт нь хөгжиж буй анхдагч ба төвийн бүсийн хооронд GA дохиоллын өндөр идэвхжил аажмаар үүссэнтэй холбоотой бөгөөд үүний зэрэгцээ анхдагч дахь GA дохионы идэвхжил буурдаг (Зураг 4c, d).
GID1b ба GID1c рецепторуудын тархалт (дээрхийг харна уу) GA рецепторуудын дифференциал илэрхийлэл нь SAM дахь GA дохионы үйл ажиллагааны хэв маягийг бүрдүүлэхэд тусалдаг болохыг харуулж байна. GA-ийн дифференциал хуримтлалтай холбоотой байж магадгүй гэж бид гайхсан. Энэ боломжийг судлахын тулд бид nlsGPS1 GA FRET мэдрэгч21-ийг ашигласан. nlsGPS1-ийн SAM-д 10 μM GA4+7-ээр 100 минутын турш боловсруулсан (Нэмэлт зураг 9a–e) идэвхжүүлэлтийн давтамж нэмэгдсэн нь nlsGPS1 нь үндэст байдаг шиг SAM дахь GA концентрацийн өөрчлөлтөд хариу үйлдэл үзүүлдэг болохыг харуулж байна21. NlsGPS1 идэвхжүүлэлтийн давтамжийн орон зайн тархалт нь SAM-ийн гаднах давхаргад харьцангуй бага GA-ийн түвшинг илрүүлсэн боловч тэдгээр нь SAM-ийн төв болон хил дээр өндөр байгааг харуулсан (Зураг 4e ба Нэмэлт зураг. 9a,c). Энэ нь GA нь qmRGA-ийн илрүүлсэнтэй харьцуулахуйц орон зайн хэв маягаар SAM-д тархсан болохыг харуулж байна. Нэмэлт арга болгон бид мөн флюресцент GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) эсвэл Fl-ийг сөрөг хяналт гэж дангаар нь авч үзсэн. Fl дохио нь бага эрчимтэй байсан ч төвийн бүс ба анхдагч хэсгийг оролцуулан SAM даяар тархсан (Зураг 4j ба Нэмэлт зураг 10d). Үүний эсрэгээр бүх гурван GA-Fl нь анхдагч хилийн хүрээнд болон бусад IPR-д янз бүрийн хэмжээгээр хуримтлагдсан бөгөөд GA7-Fl нь IPR-ийн хамгийн том домэйнд хуримтлагддаг (Зураг 4k ба Нэмэлт зураг. 10a,b). Флюресценцийн эрчмийн тоон үзүүлэлтээр GA-Fl-ээр эмчилсэн SAM-д IPR ба IPR-ийн бус эрчмийн харьцаа нь Fl-ээр эмчилсэн SAM-тай харьцуулахад өндөр байгааг илрүүлсэн (Зураг 4l ба Нэмэлт зураг. 10c). Эдгээр үр дүн нь GA нь эрхтний хилийн ойролцоо байрладаг IPR эсүүдэд илүү өндөр концентрацитай байгааг харуулж байна. Энэ нь SAM GA дохионы үйл ажиллагааны загвар нь GA рецепторуудын дифференциал илэрхийлэл ба эрхтний хилийн ойролцоох IPR эсүүдэд GA-ийн дифференциал хуримтлалаас үүсдэг болохыг харуулж байна. Тиймээс бидний хийсэн дүн шинжилгээ нь GA дохиоллын гэнэтийн орон зайн цаг хугацааны хэв маягийг илрүүлсэн бөгөөд SAM-ийн төв ба анхдагч хэсэгт бага идэвхжилтэй, захын бүсэд IPR-д илүү идэвхтэй байдаг.
SAM дахь дифференциал GA дохионы үйл ажиллагааны үүргийг ойлгохын тулд бид SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS-ийн бодит цагийн хурдацтай дүрслэлийг ашиглан GA дохиоллын идэвхжил, эсийн тэлэлт, эсийн хуваагдал хоорондын хамааралд дүн шинжилгээ хийсэн. Өсөлтийн зохицуулалт дахь GA-ийн үүргийг харгалзан эсийн тэлэлтийн параметрүүдтэй эерэг хамааралтай байх төлөвтэй байсан. Тиймээс бид эхлээд GA дохионы үйл ажиллагааны газрын зургийг эсийн гадаргуугийн өсөлтийн хурдны зурагтай (өгөгдсөн эс болон хуваагдах үеийн охин эсийн эсийн тэлэлтийн бат бөх байдлын прокси) болон эсийн тэлэлтийн чиглэлийг хэмждэг өсөлтийн анизотропийн зурагтай харьцуулсан (мөн энд өгөгдсөн эс болон хуваагдах үеийн охин эсийн хувьд ашиглагддаг; Арга, 5-р зураг, Арга, нэмэлтийг үзнэ үү). Манай SAM эсийн гадаргуугийн өсөлтийн хурдны зураг нь өмнөх ажиглалтуудтай нийцэж байна38,39, хил дээр хамгийн бага өсөлтийн хурд, хөгжиж буй цэцэгсийн хамгийн их өсөлтийн хурдтай байна (Зураг 5a). Үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн шинжилгээ (PCA) нь GA дохионы үйл ажиллагаа нь эсийн гадаргуугийн өсөлтийн эрчимтэй сөрөг хамааралтай болохыг харуулсан (Зураг 5c). Бид мөн өөрчлөлтийн гол тэнхлэгүүд, түүний дотор GA дохионы оролт ба өсөлтийн эрчмүүд нь өндөр CLV3 илэрхийлэлээр тодорхойлсон чиглэлд ортогональ байсныг харуулсан нь үлдсэн шинжилгээнд SAM төвөөс эсийг хассан болохыг баталж байна. Спирманы корреляцийн шинжилгээ нь PCA-ийн үр дүнг баталгаажуулсан (Зураг 5d) нь IPR дахь өндөр GA дохио нь эсийн өсөлтийг нэмэгдүүлэхэд хүргэдэггүйг харуулж байна. Гэсэн хэдий ч корреляцийн шинжилгээ нь GA дохионы идэвхжил ба өсөлтийн анизотропи хоёрын хооронд бага зэрэг эерэг хамаарлыг илрүүлсэн (Зураг 5c, d) нь IPR дахь GA дохионы өндөр нь эсийн өсөлтийн чиглэл, магадгүй эсийн хуваагдлын хавтгайн байрлалд нөлөөлдөг болохыг харуулж байна.
a, b САМ дахь гадаргуугийн дундаж өсөлт (a) болон өсөлтийн анизотропи (b)-ийн дулааны зураг нь бие даасан долоон ургамлын дундажийг авсан (эсийн тэлэлтийн хүч ба чиглэлийн прокси болгон ашигладаг). c PCA шинжилгээнд дараах хувьсагчдыг оруулсан: GA дохио, гадаргуугийн өсөлтийн эрчим, гадаргуугийн өсөлтийн анизотропи, CLV3 илэрхийлэл. PCA 1-р бүрэлдэхүүн хэсэг нь гадаргуугийн өсөлтийн эрчимтэй голчлон сөрөг хамааралтай, GA дохиотой эерэг хамааралтай байв. PCA 2-р бүрэлдэхүүн хэсэг нь гадаргуугийн өсөлтийн анизотропитой голчлон эерэг, CLV3 илэрхийлэлтэй сөрөг хамааралтай байв. Хувь хэмжээ нь бүрэлдэхүүн хэсэг бүрийн тайлбарласан өөрчлөлтийг илэрхийлдэг. d GA дохио, гадаргуугийн өсөлтийн эрч хүч, гадаргуугийн өсөлтийн анизотропи хоорондын хамаарлын шинжилгээ нь CZ-ийг эс тооцвол эдийн масштабаар хийгдсэн. Баруун талд байгаа тоо нь хоёр хувьсагчийн хоорондох Spearman rho утга юм. Од тэмдэг нь хамаарал/сөрөг хамаарал өндөр ач холбогдолтой тохиолдлуудыг заана. e Col-0 SAM L1 эсүүдийн 3D дүрслэлийг төвлөрсөн микроскопоор хийсэн. 10 цагийн үед SAM-д үүссэн шинэ эсийн хана (гэхдээ анхдагч биш) өнцгийн утгын дагуу өнгөтэй байна. Өнгөний мөрийг баруун доод буланд харуулав. Оруулга нь 0 цагийн үед харгалзах 3D дүрсийг харуулж байна. Туршилтыг хоёр удаа давтаж, ижил төстэй үр дүнд хүрсэн. f Хайрцагны графикууд нь IPR болон IPR бус Col-0 SAM-д эсийн хуваагдлын хурдыг харуулдаг (n = 10 бие даасан ургамал). Төвийн шугам нь медианыг, хайрцагны хил нь 25, 75-р хувийг заана. Сахал нь R програм хангамжаар тодорхойлсон хамгийн бага ба хамгийн их утгыг заана. P утгыг Welch-ийн хоёр сүүлт t-тестээр олж авсан. g, h (g) шинэ эсийн хананы өнцгийг (магент) САМ-ын төвөөс радиаль чиглэлтэй (цагаан тасархай шугам) хэрхэн хэмжихийг харуулсан бүдүүвч диаграм (зөвхөн хурц өнцгийн утгуудыг, өөрөөр хэлбэл 0-90°-ыг харгалзан үзнэ), (h) меристем доторх тойргийн/хажуугийн ба радиаль чиглэл. i SAM (хар хөх), IPR (дунд цэнхэр) болон IPR бус (цайвар цэнхэр) дээрх эсийн хуваагдлын хавтгайн чиглэлийн давтамжийн гистограмм. P утгыг хоёр сүүлт Колмогоров-Смирновын туршилтаар олж авсан. Туршилтыг хоёр удаа давтаж, ижил төстэй үр дүнд хүрсэн. j P3 (цайвар ногоон), P4 (дунд ногоон), P5 (хар ногоон) эргэн тойронд IPR-ийн эсийн хуваагдлын хавтгай чиглэлийн давтамжийн гистограмм. P утгыг хоёр сүүлт Колмогоров-Смирновын туршилтаар олж авсан. Туршилтыг хоёр удаа давтаж, ижил төстэй үр дүнд хүрсэн.
Тиймээс бид дараа нь шинжилгээний явцад шинээр үүссэн эсийн ханыг тодорхойлох замаар GA дохиолол болон эсийн хуваагдлын үйл ажиллагааны хоорондын хамаарлыг судалсан (Зураг 5e). Энэ арга нь эсийн хуваагдлын давтамж, чиглэлийг хэмжих боломжийг бидэнд олгосон. Гайхалтай нь бид IPR болон бусад SAM (IPR бус, Зураг 5f) дахь эсийн хуваагдлын давтамж ойролцоо байгааг олж мэдсэн нь IPR болон IPR бус эсүүдийн хоорондын GA дохионы ялгаа нь эсийн хуваагдалд мэдэгдэхүйц нөлөө үзүүлэхгүйг харуулж байна. Энэ болон GA дохиолол ба өсөлтийн анизотропи хоорондын эерэг хамаарал нь GA дохионы үйл ажиллагаа нь эсийн хуваагдлын хавтгайд нөлөөлж чадах эсэхийг авч үзэхэд түлхэц болсон. Бид шинэ эсийн хананы чиглэлийг меристемийн төв ба шинэ эсийн хананы төвийг холбосон радиаль тэнхлэгтэй харьцуулахад хурц өнцгөөр хэмжиж (Зураг 5e-i) радиаль тэнхлэгтэй харьцуулахад эсүүд 90 ° -тай ойролцоо өнцгөөр хуваагдах тодорхой хандлагыг ажиглаж, хамгийн өндөр давтамж нь 70-80 ° (70-80 °) (23.20%)80 болон ажиглагдсан. (22.62%) (Зураг 5e, i), тойргийн / хөндлөн чиглэлд эсийн хуваагдалд харгалзах (Зураг 5h). Энэхүү эсийн хуваагдлын зан төлөвт GA дохионы оруулсан хувь нэмрийг судлахын тулд бид IPR болон IPR-ийн бус дахь эсийн хуваагдлын параметрүүдийг тусад нь шинжилсэн (Зураг 5i). IPR эсүүд дэх хуваагдлын өнцгийн тархалт нь IPR бус эсүүд эсвэл бүхэл бүтэн SAM-ийн эсүүдээс ялгаатай болохыг бид ажигласан бөгөөд IPR эсүүд нь хажуугийн/дугуй эсийн хуваагдлын илүү их хувийг харуулдаг, өөрөөр хэлбэл 70-80 ° ба 80-90 ° (33.86% ба 30.71% (тус тус тус) 5). Тиймээс бидний ажиглалтаар өндөр GA дохиолол ба эсийн хуваагдлын хавтгай чиг баримжаа нь тойргийн чиглэлд ойрхон байгаа нь GA дохиоллын идэвхжил ба өсөлтийн анизотропи хоорондын хамааралтай төстэй (Зураг 5c, d). Энэ холбооны орон зайн хадгалалтыг цаашид тогтоохын тулд бид P3-аас эхлэн примордиумыг тойрсон IPR эсүүдийн хуваагдлын хавтгайн чиг баримжааг хэмжсэн, учир нь энэ бүсэд P4-ээс эхлэн GA дохионы хамгийн өндөр идэвхжил илэрсэн (Зураг 4). P3 ба P4-ийн эргэн тойронд IPR-ийн хуваагдлын өнцөг нь статистикийн хувьд мэдэгдэхүйц ялгааг харуулаагүй боловч P4-ийн эргэн тойронд IPR-д хажуугийн эсийн хуваагдлын давтамж нэмэгдсэн нь ажиглагдсан (Зураг 5j). Гэсэн хэдий ч P5-ийн эргэн тойрон дахь IPR эсүүдэд эсийн хуваагдлын хавтгайн чиглэлийн ялгаа нь статистикийн хувьд чухал болж, эсийн хөндлөн хуваагдлын давтамж огцом нэмэгдсэн (Зураг 5j). Эдгээр үр дүн нь GA дохиолол нь SAM дахь эсийн хуваагдлын чиг баримжааг хянах боломжтой болохыг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь GA өндөр дохиолол нь IPR дахь эсийн хуваагдлын хажуугийн чиглэлийг өдөөж болно гэсэн өмнөх тайлантай нийцэж байна40,41.
IPR дахь эсүүд нь анхдагч хэсгүүдэд биш харин завсрын хэсгүүдэд ордог гэж таамаглаж байна2,42,43. IPR дахь эсийн хуваагдлын хөндлөн чиг баримжаа нь зангилаа хоорондын эпидермисийн эсүүдийн зэрэгцээ тууш эгнээний ердийн зохион байгуулалтад хүргэж болзошгүй юм. Дээр дурдсан бидний ажиглалтаас харахад GA дохиолол нь эсийн хуваагдлын чиглэлийг зохицуулах замаар энэ үйл явцад тодорхой үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг харуулж байна.
Хэд хэдэн DELLA генүүдийн үйл ажиллагааны алдагдал нь GA-ийн үндсэн хариу урвалыг үүсгэдэг бөгөөд энэ таамаглалыг шалгахад делла мутантуудыг ашиглаж болно44. Бид эхлээд SAM дахь таван DELLA генийн илэрхийлэлд дүн шинжилгээ хийсэн. GUS шугамын транскрипцийн нэгдэл45 нь GAI, RGA, RGL1, RGL2 (бага хэмжээгээр) нь SAM-д илэрхийлэгдсэн болохыг илрүүлсэн (Нэмэлт зураг 11a-d). In situ эрлийзжүүлэлт нь GAI мРНХ нь анхдагч болон хөгжиж буй цэцэгт тусгайлан хуримтлагддаг болохыг харуулсан (Нэмэлт зураг 11e). RGL1 ба RGL3 мРНХ нь SAM халхавч болон хуучин цэцэгнээс илэрсэн бол RGL2 мРНХ нь хилийн бүсэд илүү элбэг байсан (Нэмэлт зураг 11f-h). pRGL3::RGL3-GFP SAM-ийн бүдүүлэг дүрслэл нь in situ эрлийзжүүлэлтийн үед ажиглагдсан илэрхийлэлийг баталж, RGL3 уураг нь SAM-ийн төв хэсэгт хуримтлагддаг болохыг харуулсан (Нэмэлт зураг 11i). pRGA::GFP-RGA шугамыг ашиглан бид RGA уураг нь SAM-д хуримтлагддаг боловч P4-ээс эхлэн түүний элбэг дэлбэг байдал нь хил дээр буурч байгааг олж мэдсэн (Нэмэлт зураг 11j). RGL3 ба RGA-ийн илэрхийллийн загварууд нь qmRGA-ээр илэрсэн IPR дахь GA дохионы идэвхжилтэй нийцэж байгаа нь анхаарал татаж байна (Зураг 4). Түүнчлэн, эдгээр өгөгдөл нь бүх DELLA-г SAM-д илэрхийлсэн бөгөөд тэдгээрийн илэрхийлэл нь SAM-ийг бүхэлд нь хамардаг болохыг харуулж байна.
Дараа нь бид зэрлэг төрлийн SAM (Ler, control) болон gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (дэлхийн) мутантуудын эсийн хуваагдлын параметрүүдэд дүн шинжилгээ хийсэн (Зураг 6a, b). Сонирхолтой нь бид зэрлэг төрөлтэй харьцуулахад делла глобал мутант SAM дахь эсийн хуваагдлын өнцгийн давтамжийн тархалтад статистик ач холбогдолтой өөрчлөлтийг ажигласан (Зураг 6c). Делла глобал мутант дахь энэхүү өөрчлөлт нь 80-90 ° өнцгийн давтамж нэмэгдсэн (34.71% -ийн эсрэг 24.55%) ба бага хэмжээгээр 70-80 ° өнцгийн (23.78% -ийн эсрэг 20.18%), өөрөөр хэлбэл, хөндлөн эсийн хуваагдал (Зураг 6c) нэмэгдсэнтэй холбоотой юм. Хөндлөн бус хуваагдлын давтамж (0-60 °) нь делла глобал мутантад мөн бага байсан (Зураг 6c). Делла глобал мутант (Зураг 6б)-ийн SAM-д хөндлөн эсийн хуваагдлын давтамж мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн. IPR дахь хөндлөн эсийн хуваагдлын давтамж нь зэрлэг төрөлтэй харьцуулахад делла глобал мутантад өндөр байсан (Зураг 6d). IPR бүсээс гадна зэрлэг төрөл нь эсийн хуваагдлын өнцгийн жигд тархалттай байсан бол делла глобал мутант нь IPR шиг шүргэгч хуваагдлыг илүүд үздэг байв (Зураг 6e). Мөн бид GA хуримтлагддаг GA-идэвхгүй мутант дэвсгэр болох ga2 оксидазын (ga2ox) тавын мутантуудын (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, ga2ox6-2) SAM дахь эсийн хуваагдлын чиглэлийг хэмжсэн. GA-ийн түвшний өсөлттэй уялдуулан ga2ox-ийн 5-н мутант баг цэцгийн SAM нь Col-0-ээс том байсан (Нэмэлт зураг. 12a, b) ба Col-0-тай харьцуулахад 5 ga2ox SAM нь эсийн хуваагдлын өнцгийн ялгаатай тархалтыг харуулж, давтамж нь 0 °-аас 5 ° 9 хүртэл нэмэгдэж байв. хэлтэс (Нэмэлт зураг 12a–c). Тиймээс бид GA дохиоллын үндсэн идэвхжүүлэлт ба GA хуримтлал нь IPR болон SAM-ийн бусад хэсэгт хажуугийн эсийн хуваагдлыг өдөөдөг болохыг харуулж байна.
a, b Конфокаль микроскоп ашиглан PI будсан Лер (а) ба дэлхийн дела мутант (б) SAM-ийн L1 давхаргын 3 хэмжээст дүрслэл. 10 цагийн хугацаанд SAM-д үүссэн шинэ эсийн ханыг (гэхдээ анхдагч биш) өнцгийн утгын дагуу дүрсэлж, өнгөөр будсан болно. Дотор нь SAM-г 0 цагт харуулж байна. Өнгөний самбар баруун доод буланд харагдана. (b) дахь сум нь дэлхийн делла мутант дахь зэрэгцүүлсэн эсийн файлуудын жишээг харуулж байна. Туршилтыг хоёр удаа давтаж, ижил төстэй үр дүнд хүрсэн. CE бүхэл бүтэн SAM (d), IPR (e) болон IPR бус (f) дахь эсийн хуваагдлын хавтгай чиглэлийн давтамжийн тархалтыг Лер ба глобал делла хоорондын харьцуулалт. P утгыг хоёр сүүлт Колмогоров-Смирновын тест ашиглан олж авсан. f, g Col-0 (i) ба pCUC2::gai-1-VENUS (j) трансген ургамлын PI-аар будсан SAM-ийн бүдүүлэг зургийг 3D дүрслэл. Самбар (a, b) нь 10 цагийн дотор SAM-д үүссэн шинэ эсийн ханыг (гэхдээ primordia биш) харуулж байна. Туршилтыг хоёр удаа давтаж, ижил төстэй үр дүнд хүрсэн. h–j Col-0 ба pCUC2::gai-1-VENUS ургамлын хооронд бүхэл SAM (h), IPR (i) болон IPR бус (j)-д байрлах эсийн хуваагдлын хавтгай чиглэлийн давтамжийн тархалтын харьцуулалт. P утгыг хоёр сүүлт Колмогоров-Смирнов тест ашиглан олж авсан.
Дараа нь бид IPR-д GA дохиог дарангуйлах нөлөөг шалгасан. Үүний тулд бид котиледон аяга 2 (CUC2) дэмжигчийг ашиглан ВЕНУС-тай нийлсэн зонхилох сөрөг gai-1 уургийн илэрхийлэлийг хөдөлгөв (pCUC2::gai-1-VENUS шугамд). Зэрлэг төрлийн SAM-д CUC2 дэмжигч нь P4-ээс эхлэн SAM дахь ихэнх IPR-ийн илэрхийлэл, түүний дотор хилийн эсийг жолооддог ба ижил төстэй өвөрмөц илэрхийлэл нь pCUC2::gai-1-VENUS ургамалд ажиглагдсан (доороос харна уу). pCUC2::gai-1-VENUS ургамлын SAM эсвэл IPR дахь эсийн хуваагдлын өнцгийн тархалт нь зэрлэг төрлийнхээс тийм ч их ялгаатай биш байсан ч эдгээр ургамлын IPRгүй эсүүд 80-90 ° илүү өндөр давтамжтайгаар хуваагддаг болохыг бид олж мэдсэн (Зураг 6f-j).
Эсийн хуваагдлын чиглэл нь SAM-ийн геометр, ялангуяа эдийн муруйлтаас үүсэх суналтын стрессээс хамаардаг гэж үздэг46. Тиймээс бид della глобал мутант болон pCUC2::gai-1-VENUS ургамалд SAM-ийн хэлбэр өөрчлөгдсөн эсэхийг асуусан. Өмнө мэдээлснээр12, della глобал мутант SAM-ийн хэмжээ зэрлэг төрлөөс том байсан (Нэмэлт зураг 13a, b, d). CLV3 ба STM РНХ-ийг газар дээр нь эрлийзжүүлэх нь делла мутантуудын меристемийн тэлэлтийг баталж, үүдэл эсийн үүрний хажуугийн тэлэлтийг харуулсан (Нэмэлт зураг 13e, f, h, i). Гэсэн хэдий ч SAM муруйлт нь генотипийн аль алинд нь ижил байсан (Нэмэлт зураг 13k, m, n, p). Бид gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple мутантад зэрлэг төрөлтэй харьцуулахад муруйлт өөрчлөгдөөгүй хэмжээтэй ижил төстэй өсөлт ажиглагдсан (Нэмэлт зураг 13c, d, g, j, l, o, p). Эсийн хуваагдлын чиг баримжаа нь делла дөрвөлжин мутантад мөн нөлөөлсөн боловч делла цул мутантаас бага хэмжээгээр нөлөөлсөн (Нэмэлт зураг 12d-f). Энэхүү тунгийн нөлөө нь муруйлтад нөлөө үзүүлэхгүйгээс гадна Делла дөрвөлсөн мутант дахь үлдэгдэл RGL3 идэвхжил нь DELLA идэвхжил алдагдсанаас үүсэх эсийн хуваагдлын чиг баримжаа дахь өөрчлөлтийг хязгаарлаж, эсийн хажуугийн хуваагдал нь SAM геометрийн өөрчлөлтөөс илүү GA дохионы үйл ажиллагааны өөрчлөлтийн хариуд үүсдэг болохыг харуулж байна. Дээр дурдсанчлан, CUC2 дэмжигч нь P4-ээс эхлэн SAM дахь IPR илэрхийлэлийг жолооддог (Нэмэлт зураг 14a, b) ба эсрэгээр pCUC2::gai-1-VENUS SAM нь жижиг хэмжээтэй боловч илүү муруйлттай байсан (Нэмэлт зураг 14c–h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM-ийн морфологийн энэхүү өөрчлөлт нь өндөр тойргийн хүчдэл нь SAM төвөөс богино зайд эхэлдэг зэрлэг төрөлтэй харьцуулахад механик стрессийн өөр хуваарилалтыг үүсгэж болзошгүй47. Эсвэл pCUC2::gai-1-VENUS SAM-ийн морфологийн өөрчлөлт нь трансгенийн илэрхийлэл48-аас үүдэлтэй бүс нутгийн механик шинж чанарын өөрчлөлтөөс үүдэлтэй байж болно. Аль ч тохиолдолд энэ нь бидний ажиглалтыг тайлбарлаж, эсүүд тойрог/хөндлөн чиглэлд хуваагдах магадлалыг нэмэгдүүлэх замаар GA дохиоллын өөрчлөлтийн нөлөөг хэсэгчлэн нөхөж чадна.
Хамтдаа авч үзвэл, өндөр GA дохиолол нь IPR дахь эсийн хуваагдлын хавтгайн хажуугийн чиглэлд идэвхтэй үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг баталж байна. Тэд мөн меристемийн муруйлт нь IPR дахь эсийн хуваагдлын хавтгайн чиглэлд нөлөөлдөг болохыг харуулж байна.
IPR дахь хуваагдлын хавтгайн хөндлөн чиглэл нь GA дохионы өндөр идэвхжилээс шалтгаалан GA нь эпидермисийн завсрын зангилаанд хожим олдох эсийн зохион байгуулалтыг тодорхойлохын тулд SAM дотор эпидермисийн радиаль эсийн файлыг урьдчилан зохион байгуулдаг болохыг харуулж байна. Үнэн хэрэгтээ ийм эсийн файлууд нь делла глобал мутантуудын SAM зураг дээр байнга харагддаг байсан (Зураг 6б). Тиймээс, SAM дахь GA дохиоллын орон зайн хэв маягийн хөгжлийн функцийг цаашид судлахын тулд бид зэрлэг төрлийн (Лер ба Кол-0), делла глобал мутантууд болон pCUC2:: gai-1-VENUS трансген ургамлуудын IPR дахь эсийн орон зайн зохион байгуулалтад дүн шинжилгээ хийхэд цаг хугацааны хоцрогдолтой дүрслэл ашигласан.
QmRGA нь IPR дахь GA дохионы идэвхжил P1/P2-ээс нэмэгдэж, P4-т дээд цэгтээ хүрсэн бөгөөд энэ загвар нь цаг хугацааны явцад тогтмол хэвээр байдгийг харуулсан (Зураг 4a-f ба Нэмэлт зураг 8c-f, k). Өсөн нэмэгдэж буй GA дохио бүхий IPR дахь эсийн орон зайн зохион байгуулалтад дүн шинжилгээ хийхийн тулд бид Ler IPR эсүүдийг P4-ийн дээд болон хажуу тал руу нь эхний ажиглалтаас хойш 34 цагийн дараа шинжилсэн хөгжлийн хувь заяаных нь дагуу шошгож, өөрөөр хэлбэл, хоёроос илүү пластид хугацааны дараа P1/P2-ээс P4 хүртэлх анхны хөгжлийн явцад IPR эсүүдийг дагах боломжийг олгосон. Бид гурван өөр өнгийг ашигласан: P4-ийн ойролцоох анхдагч эсүүдэд шар, IPR-д орсон эсүүдэд ногоон, хоёр үйл явцад оролцсон ягаан өнгөтэй (Зураг 7a-c). t0 (0 цаг) үед P4-ийн урд талд IPR эсийн 1-2 давхарга харагдсан (Зураг 7a). Хүлээгдэж байсанчлан эдгээр эсүүд хуваагдахдаа үүнийг голчлон хөндлөн хуваагдах хавтгайгаар хийдэг (Зураг 7a-c). Үүнтэй төстэй үр дүнг Col-0 SAM ашиглан (P3 дээр төвлөрч, тэдгээрийн хилийн нугалаа нь Лер дэх P4-тэй төстэй) авсан боловч энэ генотипийн хувьд цэцгийн хил дээр үүссэн нугалаа нь IPR эсийг илүү хурдан нуудаг (Зураг 7g-i). Тиймээс IPR эсийн хуваагдлын хэв маяг нь эсийг завсрын зангилаа шиг радиаль эгнээ болгон урьдчилан зохион байгуулдаг. Цацрагийн эгнээний зохион байгуулалт, дараалсан эрхтнүүдийн хооронд IPR эсийг нутагшуулах нь эдгээр эсүүд нь зангилаа хоорондын өвөг дээдэс болохыг харуулж байна.
Энд бид GA болон GA рецепторын хосолсон концентрацийн үр дүнд бий болсон GA дохиоллын үйл ажиллагааны тоон зураглалыг гаргахын зэрэгцээ эндоген дохионы замд үзүүлэх хөндлөнгийн оролцоог багасгаж, улмаар эсийн түвшинд GA функцын талаар мэдээлэл өгөх боломжийг олгодог харьцаа хэмжигч GA дохионы биосенсорыг бүтээсэн qmRGA. Үүний тулд бид DELLA-ийн харилцан үйлчлэлийн түншүүдийг холбох чадвараа алдсан боловч GA-ийн өдөөгдсөн протеолизэд мэдрэмтгий хэвээр байгаа DELLA уураг, mRGA-г бүтээсэн. qmRGA нь GA түвшний экзоген болон эндоген өөрчлөлтөд хариу үйлдэл үзүүлдэг бөгөөд түүний динамик мэдрэх шинж чанар нь хөгжлийн явцад GA дохионы үйл ажиллагааны орон зайн цаг хугацааны өөрчлөлтийг үнэлэх боломжийг олгодог. qmRGA нь мөн маш уян хатан хэрэгсэл бөгөөд үүнийг илэрхийлэхэд ашигладаг дэмжигчийг (шаардлагатай бол) өөрчилснөөр өөр өөр эд эсэд дасан зохицож чаддаг бөгөөд ангиоспермүүд дэх GA дохионы зам болон PFYRE сэдвийн хадгалагдсан шинж чанарыг харгалзан үзвэл бусад зүйлүүдэд шилжүүлэх боломжтой22. Үүнтэй уялдуулан цагаан будааны SLR1 DELLA уураг (HYY497AAA) ижил төстэй мутаци нь SLR1-ийн өсөлтийг дарангуйлагчийн идэвхийг дарангуйлж, mRGA23-тай адил GA-ийн доройтлыг бага зэрэг бууруулдаг болохыг харуулсан. Арабидопсисын сүүлийн үеийн судалгаагаар PFYRE домэйны (S474L) нэг амин хүчлийн мутаци нь транскрипцийн хүчин зүйлийн түншүүдтэй харилцах чадварт нөлөөлөхгүйгээр RGA-ийн транскрипцийн идэвхийг өөрчилсөн болохыг харуулж байна50. Хэдийгээр энэ мутаци нь mRGA-д агуулагдах 3 амин хүчлийг орлуулахтай маш ойрхон боловч бидний судалгаагаар эдгээр хоёр мутаци нь DELLA-ийн ялгаатай шинж чанарыг өөрчилдөг болохыг харуулж байна. Ихэнх транскрипцийн хүчин зүйлийн түншүүд DELLA26,51-ийн LHR1 ба SAW домэйнтэй холбогддог ч PFYRE домэйн дэх зарим хадгалагдсан амин хүчлүүд нь эдгээр харилцан үйлчлэлийг тогтворжуулахад тусалдаг.
Завсрын хөгжил нь ургамлын архитектур, ургацыг сайжруулах гол шинж чанар юм. qmRGA нь IPR хоорондын зангилаа удамшлын эсүүдэд илүү өндөр GA дохионы идэвхийг илрүүлсэн. Тоон дүрслэл болон генетикийг хослуулснаар бид GA дохиоллын загвар нь SAM эпидермисийн дугуй/хөндлөн эсийн хуваагдлын хавтгайг давхарлаж, зангилаа хоорондын хөгжилд шаардлагатай эсийн хуваагдлын зохион байгуулалтыг бүрдүүлдэг болохыг харуулсан. Хөгжлийн явцад эсийн хуваагдлын хавтгай чиглэлийн хэд хэдэн зохицуулагчийг тодорхойлсон байдаг52,53. Бидний ажил нь GA дохионы үйл ажиллагаа нь үүрэн холбооны энэ параметрийг хэрхэн зохицуулдгийн тод жишээ юм. DELLA нь урд талын уургийн цогцолборуудтай41 харилцан үйлчилж чаддаг тул GA дохиолол нь кортикал микро гуурсан хоолойн чиг баримжаанд шууд нөлөөлж эсийн хуваагдлын хавтгайн чиг баримжааг зохицуулж чаддаг40,41,54,55. Бид гэнэтийн байдлаар SAM-д GA дохиоллын өндөр үйл ажиллагааны хамаарал нь эсийн суналт, хуваагдал биш, харин зөвхөн өсөлтийн анизотропи байсан нь IPR дахь эсийн хуваагдлын чиглэлд GA-ийн шууд нөлөөлөлтэй нийцэж байгааг бид гэнэт харуулсан. Гэсэн хэдий ч энэ нөлөө нь шууд бус, жишээлбэл, GA-ийн өдөөгдсөн эсийн ханыг зөөлрүүлэх замаар дамждаг гэдгийг үгүйсгэх аргагүй юм56. Эсийн хананы шинж чанарын өөрчлөлт нь механик стрессийг өдөөдөг57,58 бөгөөд энэ нь кортикал микротубулуудын чиг баримжаанд нөлөөлж эсийн хуваагдлын хавтгайд нөлөөлж болно39,46,59. GA-аас үүдэлтэй механик стресс ба микротубулын чиг баримжааг GA-ийн шууд зохицуулалтын хосолсон нөлөө нь IPR-д эсийн хуваагдлын чиг баримжааны тодорхой загварыг бий болгоход оролцож болох бөгөөд энэ санааг шалгахын тулд цаашдын судалгаа хийх шаардлагатай байна. Үүний нэгэн адил, өмнөх судалгаагаар DELLA-тай харилцан үйлчилдэг TCP14 ба 15 уураг нь зангилаа хоорондын үүсэхийг хянахад чухал ач холбогдолтой болохыг онцлон тэмдэглэсэн байдаг60,61 эдгээр хүчин зүйлүүд нь зангилаа хоорондын хөгжлийг зохицуулдаг BREVIPEDICELLUS (BP) болон PENNYWISE (PNY)-тэй хамт GA-ийн үйл ажиллагааг зуучилж, GA2 дохиололд нөлөөлдөг болохыг харуулсан. DELLA нь брассиностероид, этилен, жасмоны хүчил, абсцизын хүчил (ABA) дохионы замуудтай харилцан үйлчилдэг63,64 ба эдгээр дааврууд нь микро гуурсан хоолойн чиг баримжаатай65 нөлөөлж болохыг харгалзан үзвэл эсийн хуваагдлын чиг баримжаа дахь GA-ийн нөлөөг бусад дааварууд бас зуучилж болно.
Эрт үеийн цитологийн судалгаагаар Арабидопсисын САМ-ийн дотоод болон гадаад бүс нь зангилаа хоорондын хөгжилд шаардлагатай болохыг харуулсан2,42. GA нь дотоод эдэд эсийн хуваагдлыг идэвхтэй зохицуулдаг12 нь SAM дахь меристем ба зангилаа хоорондын хэмжээг зохицуулах GA-ийн давхар функцийг дэмждэг. Эсийн чиглэлийн хуваагдлын хэв маяг нь мөн дотоод SAM эдэд хатуу зохицуулагддаг бөгөөд энэ зохицуулалт нь ишний өсөлтөд зайлшгүй шаардлагатай52. GA нь SAM-ийн дотоод зохион байгуулалт дахь эсийн хуваагдлын хавтгайг чиглүүлж, улмаар SAM доторх завсрын зангилааг тодорхойлох, хөгжүүлэхэд синхрончлох үүрэг гүйцэтгэдэг эсэхийг судлах нь сонирхолтой байх болно.
Ургамлыг in vitro хөрсөнд эсвэл 1% сахароз, 1% агар (Сигма) нэмсэн 1х Мурашиге-Скоог (MS) тэжээлт орчинд (Дучефа) стандарт нөхцөлд (16 цагийн гэрэл, 22 ° C) суулгацыг гипокотил ба үндэс ургуулах туршилтаас бусад тохиолдолд ургуулсан. Нитратын туршилтын хувьд ургамлыг урт өдрийн нөхцөлд хангалттай нитрат (0 эсвэл 10 мМ KNO3), 0.5 мМ NH4-сукцинат, 1% сахароз, 1% А-агар (Сигма) агуулсан өөрчлөгдсөн MS тэжээлт орчинд (bioWORLD ургамлын орчин) ургуулсан.
pDONR221-д оруулсан GID1a cDNA-г pDONR P4-P1R-pUBQ10 болон pDONR P2R-P3-mCherry-тай pB7m34GW болгон нэгтгэж, pUBQ10::GID1a-mCherry-г үүсгэсэн. pDONR221-д оруулсан IDD2 ДНХ-г pB7RWG266 руу дахин нэгтгэж p35S:IDD2-RFP үүсгэсэн. pGID1b::2xmTQ2-GID1b-г үүсгэхийн тулд эхлээд GID1b кодчиллын бүсийн 3.9 кб фрагмент ба GID1b cDNA (1.3 кб) ба терминатор (3.4 кб) агуулсан 4.7 кб фрагментийг эхлээд нэмэлт T3R-д праймеруудыг ашиглан өсгөж, дараа нь P1-R-д оруулах боломжтой. (Thermo Fisher Scientific) ба pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) тус тусад нь pDONR221 2xmTQ268-тай Gateway клончлолыг ашиглан pGreen 012567 зорилтот вектор болгон нэгтгэв. pCUC2::LSSmOrange үүсгэхийн тулд CUC2 промотерийн дараалал (ATG-ээс дээш 3229 bp), дараа нь N7 цөмийн локалчлалын дохио бүхий том Стоксоор шилжсэн mOrange (LSSmOrange)69-ийн кодчиллын дараалал ба NOS транскрипцийн терминаторыг pGreate-ийн зорилтот векторын G-ийн зорилтот векторыг ашиглан угсарсан. рекомбинацын систем (Invitrogen). Ургамлын хоёртын векторыг Agrobacterium tumefaciens омгийн GV3101-д, Nicotiana benthamiana-ийн навчинд Agrobacterium нэвчилтийн аргаар, Arabidopsis thaliana Col-0-д цэцэгт дүрэх аргаар тус тус нэвтрүүлсэн. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry болон pCLV3::mCherry-NLS qmRGA нь тус тусын загалмайн F3 ба F1 үр удмаас тусгаарлагдсан.
РНХ in situ эрлийзжүүлэх ажлыг ойролцоогоор 1 см урт найлзуурын үзүүрт хийсэн72, тэдгээрийг цуглуулж, нэн даруй FAA уусмалд (3.7% формальдегид, 5% цууны хүчил, 50% этилийн спирт) урьдчилан 4 ° C хүртэл хөргөнө. 2 × 15 минутын вакуум эмчилгээний дараа бэхлэгчийг сольж, дээжийг нэг шөнийн дотор өсгөвөрлөсөн. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, RGL3 cDNA болон тэдгээрийн 3′-UTR-ийн антисенс мэдрэгчийг Rosier нар тайлбарласны дагуу 3-р хүснэгтэд үзүүлсэн праймеруудыг ашиглан нийлэгжүүлсэн. Дигоксигенин шошготой датчикуудыг дигоксигениний эсрэгбие (3000 дахин шингэлэх; Рош, каталогийн дугаар: 11 093 274 910) ашиглан дархлаа илрүүлж, хэсгүүдийг 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат (BCIP-500-ийн шингэрүүлэлт) -ээр будсан. (NBT, 200 дахин шингэлэх) уусмал.
Шуудангийн цаг: 2025 оны 2-р сарын 10