Найлзуурын оройн меристем (SAM)-ийн өсөлт нь ишний бүтцэд чухал үүрэгтэй. Ургамлын дааваргиббереллинүүд(GAs) нь ургамлын өсөлтийг зохицуулахад гол үүрэг гүйцэтгэдэг боловч SAM дахь тэдгээрийн үүрэг нь сайн ойлгогдоогүй хэвээр байна. Энд бид DELLA уургийг инженерчлэл хийснээр GA транскрипцийн хариу урвал дахь түүний чухал зохицуулалтын үүргийг дарангуйлахын зэрэгцээ GA таних үед түүний задралыг хадгалах замаар GA дохиоллын харьцааны биосенсорыг боловсруулсан. Бид энэхүү задралд суурилсан биосенсор нь хөгжлийн явцад GA түвшин болон эсийн мэдрэгчийн өөрчлөлтийг үнэн зөв бүртгэдэг болохыг харуулсан. Бид энэхүү биосенсорыг SAM дахь GA дохиоллын идэвхжлийг зураглахад ашигласан. Бид өндөр GA дохио нь голчлон зангилаа хоорондын эсүүдийн урьдал үе болох эрхтэний анхдагч эсүүдийн хооронд байрладаг эсүүдэд байдаг болохыг харуулж байна. Үйл ажиллагааны олз ба алдагдлын аргыг ашиглан бид GA нь эсийн хуваагдлын хавтгайн чиглэлийг зохицуулж, зангилаа хоорондын каноник эсийн зохион байгуулалтыг бий болгож, улмаар SAM дахь зангилаа хоорондын тодорхойлолтыг дэмждэг болохыг цаашид харуулж байна.
Найлзуурын оройд байрлах найлзуурын оройн меристем (SAM) нь ургамлын амьдралын туршид хажуугийн эрхтэн ба ишний зангилааг модульчлагдсан болон давтагдах байдлаар үүсгэдэг үүдэл эсийн орон зайг агуулдаг. Эдгээр давтагдах нэгж буюу ургамлын зангилаа бүр нь зангилааны завсрын болон хажуугийн эрхтэнүүд, навчны суганы суганы меристемүүдийг агуулдаг1. Ургамлын зангилааны өсөлт, зохион байгуулалт нь хөгжлийн явцад өөрчлөгддөг. Арабидопсисд ургамлын үе шатанд завсрын өсөлт дарагддаг бөгөөд суганы меристем нь сарнай навчны суганд идэвхгүй хэвээр байдаг. Цэцгийн үе шатанд шилжих үед SAM нь баг цэцгийн меристем болж, сунасан завсрын болон суганы нахиа, цэцэгт навчны суганы салаа, хожим нь навчгүй цэцэг үүсгэдэг2. Навч, цэцэг, мөчир үүсэхийг хянадаг механизмыг ойлгоход бид мэдэгдэхүйц ахиц дэвшил гаргасан ч завсрын зангилаа хэрхэн үүсдэг талаар харьцангуй бага мэдээлэлтэй байдаг.
GA-ийн орон зайн-цаг хугацааны тархалтыг ойлгох нь эдгээр дааврын үйл ажиллагааг өөр өөр эд эс болон хөгжлийн янз бүрийн үе шатанд илүү сайн ойлгоход тусална. Өөрийн промоутерын үйлчлэлээр илэрхийлэгдсэн RGA-GFP нэгдлийн задралыг дүрслэн харуулах нь үндэс дэх нийт GA түвшинг зохицуулах талаар чухал мэдээлэл өгдөг15,16. Гэсэн хэдий ч RGA-ийн илэрхийлэл нь эд эсэд харилцан адилгүй байдаг17 бөгөөд GA18-аар зохицуулагддаг. Тиймээс RGA промоутерын дифференциал илэрхийлэл нь RGA-GFP-ээр ажиглагдсан флуоресценцийн хэв маягт хүргэж болзошгүй тул энэ арга нь тоон үзүүлэлт биш юм. Саяхан био идэвхт флуоресцеин (Fl)-ээр тэмдэглэгдсэн GA19,20 нь үндэсний эндокортекст GA хуримтлагдаж, түүний эсийн түвшинг GA тээвэрлэлтээр зохицуулж байгааг илрүүлсэн. Саяхан GA FRET мэдрэгч nlsGPS1 нь GA-ийн түвшин нь үндэс, утаслаг, харанхуй ургасан гипокотил дахь эсийн суналттай хамааралтай болохыг харуулсан21. Гэсэн хэдий ч бидний харж байгаагаар GA-ийн концентраци нь GA дохиоллын үйл ажиллагааг хянадаг цорын ганц параметр биш бөгөөд энэ нь нарийн төвөгтэй мэдрэхүйн процессуудаас хамаардаг. Энд бид DELLA болон GA дохиоллын замын талаарх ойлголт дээрээ үндэслэн GA дохиоллын задралд суурилсан харьцааны биосенсорын хөгжүүлэлт болон шинж чанарыг мэдээлж байна. Энэхүү тоон биосенсорыг боловсруулахын тулд бид флуоресцент уурагтай нийлж, эдэд хаа сайгүй илэрхийлэгддэг мутант GA-мэдрэмтгий RGA, мөн GA-мэдрэмтгий бус флуоресцент уураг ашигласан. Бид мутант RGA уургийн нэгдэл нь хаа сайгүй илэрхийлэгддэг үед эндоген GA дохиололд саад болдоггүй бөгөөд энэхүү биосенсор нь мэдрэгч төхөөрөмжөөр GA оролт болон GA дохиог боловсруулсны үр дүнд үүссэн дохиоллын үйл ажиллагааг өндөр орон зайн-цаг хугацааны нягтралтайгаар тоон үзүүлэлтээр тодорхойлж чаддаг болохыг харуулж байна. Бид энэхүү биосенсорыг GA дохиоллын үйл ажиллагааны орон зайн-цаг хугацааны тархалтыг зураглах, GA нь SAM эпидермис дэх эсийн зан төлөвийг хэрхэн зохицуулдагийг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлоход ашигласан. Бид GA нь эрхтэний анхдагч эсүүдийн хооронд байрлах SAM эсүүдийн хуваах хавтгайн чиглэлийг зохицуулж, улмаар зангилаа хоорондын каноник эсийн зохион байгуулалтыг тодорхойлдог болохыг харуулж байна.
Эцэст нь бид qmRGA нь өсөн нэмэгдэж буй гипокотилуудыг ашиглан эндоген GA түвшний өөрчлөлтийг мэдээлж чадах эсэхийг асуусан. Бид өмнө нь нитрат нь GA нийлэгжилтийг нэмэгдүүлж, улмаар DELLA34 задралыг нэмэгдүүлснээр өсөлтийг өдөөдөг болохыг харуулсан. Үүний дагуу бид нитратын элбэг дэлбэг хангамж (10 мМ NO3−) дор ургуулсан pUBQ10::qmRGA суулгацын гипокотил урт нь нитрат дутагдалтай нөхцөлд ургуулсан суулгацаас хамаагүй урт байгааг ажигласан (Нэмэлт Зураг 6a). Өсөлтийн хариу урвалтай нийцүүлэн 10 мМ NO3− нөхцөлд ургуулсан суулгацын гипокотилд GA дохио нь нитрат байхгүй үед ургуулсан суулгацаас өндөр байсан (Нэмэлт Зураг 6b, c). Тиймээс qmRGA нь GA концентрацийн эндоген өөрчлөлтөөс үүдэлтэй GA дохиоллын өөрчлөлтийг хянах боломжийг олгодог.
qmRGA-аар илрүүлсэн GA дохиоллын идэвхжил нь мэдрэгчийн загвар дээр үндэслэн GA-ийн концентраци болон GA-ийн ойлголтоос хамаардаг эсэхийг ойлгохын тулд бид ургамлын болон нөхөн үржихүйн эдэд гурван GID1 рецепторын илэрхийлэлийг шинжилсэн. Суулгацанд GID1-GUS сурвалжлагч шугам нь GID1a болон c нь навч, хажуугийн үндэсний анхдагч навч, үндэсний үзүүр (GID1b-ийн үндэсний тагнаас бусад) болон судасны системд илэрхийлэгддэг (Зураг 3a-c). Баг цэцгийн SAM-д бид зөвхөн GID1b болон 1c-ийн GUS дохиог илрүүлсэн (Нэмэлт Зураг 7a-c). In situ эрлийзжүүлэлт нь эдгээр илэрхийлэлийн хэв маягийг баталгаажуулж, GID1c нь SAM-д бага түвшинд жигд илэрхийлэгдсэн бол GID1b нь SAM-ийн захад илүү өндөр илэрхийлэл үзүүлсэн болохыг харуулсан (Нэмэлт Зураг 7d-l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b трансляцийн нэгдэл нь SAM-ийн төвд бага эсвэл огт илэрхийлэлгүй байхаас эрхтний хил дээр өндөр илэрхийлэл хүртэл GID1b илэрхийлэлийн шаталсан хүрээг харуулсан (Нэмэлт Зураг 7m). Тиймээс GID1 рецепторууд эд эсийн дотор болон эд эсийн хооронд жигд тархаагүй байна. Дараагийн туршилтуудад бид GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry)-ийн хэт илэрхийлэл нь гипокотил дахь qmRGA-ийн гадны GA хэрэглээнд мэдрэмтгий байдлыг нэмэгдүүлсэн болохыг ажигласан (Зураг 3d, e). Үүний эсрэгээр гипокотил дахь qd17mRGA-аар хэмжсэн флуоресценц нь GA3 эмчилгээнд мэдрэмтгий бус байсан (Зураг 3f, g). Хоёр шинжилгээний хувьд мэдрэгчийн хурдан зан төлөвийг үнэлэхийн тулд суулгацыг өндөр концентрацитай GA (100 μM GA3)-ээр боловсруулсан бөгөөд GID1 рецептортой холбогдох чадвар сайжирсан эсвэл алдагдсан. Эдгээр үр дүнгүүд нь qmRGA биосенсор нь GA болон GA мэдрэгчийн хосолсон функцийг гүйцэтгэдэг болохыг баталж байгаа бөгөөд GID1 рецепторын дифференциал илэрхийлэл нь мэдрэгчийн цацрагийн чадварыг мэдэгдэхүйц өөрчилж чадна гэдгийг харуулж байна.
Өнөөдрийг хүртэл SAM дахь GA дохионы тархалт тодорхойгүй хэвээр байна. Тиймээс бид qmRGA илэрхийлэгч ургамал болон pCLV3::mCherry-NLS үүдэл эсийн репортер35-ийг ашиглан GA дохионы үйл ажиллагааны өндөр нарийвчлалтай тоон газрын зургийг тооцоолж, L1 давхарга (эпидермис; Зураг 4a, b, Арга зүй ба Нэмэлт аргуудыг үзнэ үү) дээр анхаарлаа төвлөрүүлсэн, учир нь L1 нь SAM-ийн өсөлтийг хянах гол үүрэг гүйцэтгэдэг36. Энд pCLV3::mCherry-NLS илэрхийлэл нь GA дохионы үйл ажиллагааны орон зайн-цаг хугацааны тархалтыг шинжлэх тогтмол геометрийн лавлах цэгийг өгсөн37. GA нь хажуугийн эрхтний хөгжилд зайлшгүй шаардлагатай гэж үздэг4 боловч P3 үе шатнаас эхлэн цэцгийн анхдагч (P) хэсэгт GA дохио бага байгааг бид ажигласан (Зураг 4a, b), харин залуу P1 ба P2 анхдагч нь төвийн бүстэй төстэй дунд зэргийн идэвхжилтэй байсан (Зураг 4a, b). P1/P2-ээс (хилийн хажуу талаас) эхэлж, P4 дээр оргил үедээ хүрсэн эрхтэний анхдагч хил хязгаарт, мөн анхдагч хэсгүүдийн хооронд байрлах захын бүсийн бүх эсүүдэд GA дохиоллын өндөр идэвхжил илэрсэн (Зураг 4a, b болон Нэмэлт Зураг 8a, b). Энэхүү илүү өндөр GA дохиоллын идэвхжил нь зөвхөн эпидермисэд төдийгүй L2 болон дээд L3 давхаргад ажиглагдсан (Нэмэлт Зураг 8b). qmRGA ашиглан SAM-д илрүүлсэн GA дохиоллын хэв маяг цаг хугацааны явцад өөрчлөгдөөгүй хэвээр байсан (Нэмэлт Зураг 8c–f, k). Хэдийгээр qd17mRGA бүтэц нь бидний нарийвчлан тодорхойлсон таван бие даасан шугамаас T3 ургамлын SAM-д системтэйгээр буурсан боловч бид pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP бүтэц ашиглан олж авсан флуоресценцийн хэв маягийг шинжлэх боломжтой байсан (Нэмэлт Зураг 8g–j, l). Энэхүү хяналтын шугамд SAM-д флуоресценцийн харьцаанд бага зэргийн өөрчлөлтүүд илэрсэн боловч SAM төвд бид TagBFP-тэй холбоотой VENUS-ийн тодорхой бөгөөд гэнэтийн бууралтыг ажигласан. Энэ нь qmRGA-аар ажиглагдсан дохиоллын хэв маяг нь mRGA-VENUS-ийн GA-аас хамааралтай доройтлыг тусгаж байгааг баталж байгаа боловч qmRGA нь меристем төвд GA дохиоллын идэвхийг хэт үнэлж болохыг харуулж байна. Товчхондоо, бидний үр дүнгээс харахад анхдагч эсийн тархалтыг голчлон тусгасан GA дохиоллын хэв маяг илэрч байна. Анхдагч эсийн хоорондох бүсийн (IPR) энэхүү тархалт нь хөгжиж буй анхдагч эс болон төвийн бүсийн хооронд өндөр GA дохиоллын идэвхжил аажмаар тогтсонтой холбоотой бөгөөд үүний зэрэгцээ анхдагч эсийн GA дохиоллын идэвхжил буурч байна (Зураг 4c, d).
GID1b болон GID1c рецепторуудын тархалт (дээрхийг үзнэ үү) нь GA рецепторуудын дифференциал илэрхийлэл нь SAM дахь GA дохиоллын үйл ажиллагааны хэв маягийг бүрдүүлэхэд тусалдаг болохыг харуулж байна. Бид GA-ийн дифференциал хуримтлал оролцож болох эсэхийг гайхаж байсан. Энэ боломжийг судлахын тулд бид nlsGPS1 GA FRET мэдрэгч21-ийг ашигласан. 10 μM GA4+7-оор 100 минутын турш эмчилсэн nlsGPS1-ийн SAM-д идэвхжүүлэлтийн давтамж нэмэгдсэн нь илэрсэн (Нэмэлт Зураг 9a–e), энэ нь nlsGPS1 нь үндэс21-тэй адил SAM дахь GA концентрацийн өөрчлөлтөд хариу үйлдэл үзүүлдэг болохыг харуулж байна. nlsGPS1 идэвхжүүлэлтийн давтамжийн орон зайн тархалт нь SAM-ийн гаднах давхаргад GA-ийн түвшин харьцангуй бага байгааг харуулсан боловч тэдгээр нь SAM-ийн төв болон хил дээр өндөр байгааг харуулсан (Зураг 4e болон Нэмэлт Зураг 9a,c). Энэ нь GA нь SAM-д qmRGA-аар илэрсэнтэй харьцуулах орон зайн хэв маягаар тархсан болохыг харуулж байна. Нэмэлт аргачлал болгон бид SAM-ийг флуоресцент GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) эсвэл сөрөг хяналт болгон дангаар нь Fl-ээр эмчилсэн. Fl дохио нь төвийн бүс болон анхдагч хэсгийг оролцуулан SAM даяар тархсан боловч бага эрчимтэй байсан (Зураг 4j болон Нэмэлт Зураг 10d). Үүний эсрэгээр гурван GA-Fl бүгд анхдагч хил хязгаар дотор болон IPR-ийн үлдсэн хэсэгт янз бүрийн хэмжээгээр хуримтлагдсан бөгөөд GA7-Fl нь IPR-ийн хамгийн том домэйнд хуримтлагдсан (Зураг 4k болон Нэмэлт Зураг 10a,b). Флуоресценцийн эрчмийг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлоход Fl-ээр эмчилсэн SAM-тай харьцуулахад GA-Fl-ээр эмчилсэн SAM-д IPR-ээс IPR бус эрчимжилтийн харьцаа өндөр байсан нь тогтоогдсон (Зураг 4l болон Нэмэлт Зураг 10c). Эдгээр үр дүнгүүд нь GA нь эрхтний хил хязгаарт хамгийн ойр байрладаг IPR эсүүдэд илүү өндөр концентрацид байгааг харуулж байна. Энэ нь SAM GA дохиоллын идэвхжилийн хэв маяг нь GA рецепторуудын дифференциал илэрхийлэл болон эрхтний хил орчмын IPR эсүүдэд GA-ийн дифференциал хуримтлалаас үүдэлтэй болохыг харуулж байна. Тиймээс бидний шинжилгээгээр SAM-ийн төв ба анхдагч хэсэгт идэвхжил бага, захын бүсэд IPR-ийн идэвхжил өндөр байгаа нь GA дохиоллын гэнэтийн орон зайн-цаг хугацааны хэв маягийг илрүүлсэн.
SAM дахь GA-ийн дифференциал дохиоллын үйл ажиллагааны үүргийг ойлгохын тулд бид SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS-ийн бодит цагийн цагийн зураглалыг ашиглан GA дохиоллын үйл ажиллагаа, эсийн тэлэлт болон эсийн хуваагдлын хоорондын хамаарлыг шинжилсэн. GA-ийн өсөлтийн зохицуулалт дахь үүргийг харгалзан үзвэл эсийн тэлэлтийн параметрүүдтэй эерэг хамаарал байх төлөвтэй байсан. Тиймээс бид эхлээд GA дохиоллын үйл ажиллагааны газрын зургийг эсийн гадаргуугийн өсөлтийн хурдны газрын зурагтай (өгөгдсөн эс болон хуваагдах үеийн охин эсүүдийн эсийн тэлэлтийн хүчийг төлөөлөх зорилгоор) болон эсийн тэлэлтийн чиглэлийг хэмждэг өсөлтийн анизотропийн газрын зурагтай (энд өгөгдсөн эс болон хуваагдах үеийн охин эсүүдэд мөн ашигласан; Зураг 5a, b, Арга зүй ба Нэмэлт аргуудыг үзнэ үү) харьцуулсан. SAM эсийн гадаргуугийн өсөлтийн хурдны бидний газрын зураг нь өмнөх ажиглалтуудтай нийцэж байгаа бөгөөд хил хязгаарт хамгийн бага өсөлтийн хурд, хөгжиж буй цэцэгсийн хамгийн их өсөлтийн хурдтай байна (Зураг 5a). Үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн шинжилгээ (PCA) нь GA дохиоллын үйл ажиллагаа нь эсийн гадаргуугийн өсөлтийн эрчимтэй сөрөг хамааралтай болохыг харуулсан (Зураг 5c). Мөн бид GA дохиоллын оролт болон өсөлтийн эрчим зэрэг хувьсах гол тэнхлэгүүд нь өндөр CLV3 экспрессээр тодорхойлогдсон чиглэлтэй ортогональ байгааг харуулсан бөгөөд үлдсэн шинжилгээнд эсүүдийг SAM төвөөс хассан болохыг баталсан. Спирманы корреляцийн шинжилгээ нь PCA үр дүнг баталгаажуулсан (Зураг 5d) бөгөөд энэ нь IPR дахь GA дохио өндөр байх нь эсийн тэлэлтийг нэмэгдүүлэхэд хүргэсэнгүй болохыг харуулж байна. Гэсэн хэдий ч корреляцийн шинжилгээгээр GA дохиоллын идэвхжил ба өсөлтийн анизотропийн хооронд бага зэрэг эерэг хамаарал илэрсэн (Зураг 5c, d), энэ нь IPR дахь GA дохио өндөр байх нь эсийн өсөлтийн чиглэл болон эсийн хуваагдлын хавтгайн байрлалд нөлөөлдөг болохыг харуулж байна.
a, b SAM-д гадаргуугийн дундаж өсөлт (a) болон өсөлтийн анизотропийн (b) дулааны зураглал нь долоон бие даасан ургамлын дунджаар хийгдсэн (эсийн тэлэлтийн хүч чадал болон чиглэлийг тус тус прокси болгон ашигласан). c PCA шинжилгээнд дараах хувьсагчдыг оруулсан: GA дохио, гадаргуугийн өсөлтийн эрчим, гадаргуугийн өсөлтийн анизотроп, CLV3 илэрхийлэл. PCA бүрэлдэхүүн хэсэг 1 нь гадаргуугийн өсөлтийн эрчимтэй голчлон сөрөг хамааралтай бөгөөд GA дохиотой эерэг хамааралтай байв. PCA бүрэлдэхүүн хэсэг 2 нь гадаргуугийн өсөлтийн анизотроптой голчлон эерэг хамааралтай бөгөөд CLV3 илэрхийлэлтэй сөрөг хамааралтай байв. Хувь нь бүрэлдэхүүн хэсэг тус бүрээр тайлбарласан хэлбэлзлийг илэрхийлнэ. d CZ-г оруулаагүй эдийн хэмжээний GA дохио, гадаргуугийн өсөлтийн эрчим, гадаргуугийн өсөлтийн анизотропийн хоорондох Спирманы корреляцийн шинжилгээ. Баруун талын тоо нь хоёр хувьсагчийн хоорондох Спирманы rho утга юм. Од тэмдэг нь корреляци/сөрөг корреляци маш чухал ач холбогдолтой тохиолдлуудыг заана. e Конфокал микроскопоор Col-0 SAM L1 эсийн 3 хэмжээст дүрслэл. 10 цагийн дараа SAM-д (гэхдээ анхдагч хэсэгт биш) үүссэн шинэ эсийн ханыг өнцгийн утгуудын дагуу өнгөөр будсан. Өнгөний мөрийг баруун доод буланд харуулав. Оруулга нь 0 цагийн дараа харгалзах 3D зургийг харуулж байна. Туршилтыг хоёр удаа давтаж, ижил төстэй үр дүн гарсан. f Хайрцагны графикууд нь IPR болон IPR бус Col-0 SAM (n = 10 бие даасан ургамал) дахь эсийн хуваагдлын хурдыг харуулна. Төвийн шугам нь медианыг, хайрцагны хил хязгаар нь 25 ба 75 дахь перцентилийг заана. Сахал нь R програм хангамжаар тодорхойлсон хамгийн бага ба хамгийн их утгуудыг заана. P утгуудыг Уэлчийн хоёр сүүлт t-тестээр олж авсан. g, h (g) SAM-ийн төвөөс (цагаан цэгэн шугам) радиаль чиглэлтэй харьцуулахад шинэ эсийн хананы (нил ягаан) өнцгийг хэрхэн хэмжихийг харуулсан схемийн диаграмм (зөвхөн хурц өнцгийн утгуудыг, өөрөөр хэлбэл 0–90°-ийг харгалзан үзнэ), мөн (h) меристем доторх тойргийн/хажуугийн ба радиаль чиглэлийг харуулсан. i SAM (хар хөх), IPR (дунд цэнхэр) болон IPR бус (цайвар цэнхэр) дээрх эсийн хуваагдлын хавтгайн чиглэлийн давтамжийн гистограммуудыг тус тус харуулав. P утгыг хоёр сүүлт Колмогоров-Смирновын тестээр олж авсан. Туршилтыг хоёр удаа давтан хийж, ижил төстэй үр дүнд хүрсэн. j IPR-ийн P3 (цайвар ногоон), P4 (дунд ногоон) болон P5 (хар ногоон) орчимд эсийн хуваагдлын хавтгайн чиглэлийн давтамжийн гистограммуудыг тус тус харуулав. P утгыг хоёр сүүлт Колмогоров-Смирновын тестээр олж авсан. Туршилтыг хоёр удаа давтан хийж, ижил төстэй үр дүнд хүрсэн.
Тиймээс бид дараа нь шинжилгээний явцад шинээр үүссэн эсийн ханыг тодорхойлж, GA дохиолол болон эсийн хуваагдлын идэвхжилийн хоорондын хамаарлыг судалсан (Зураг 5e). Энэ арга нь бидэнд эсийн хуваагдлын давтамж болон чиглэлийг хэмжих боломжийг олгосон. Гайхалтай нь бид IPR болон SAM-ийн бусад хэсэгт (IPR бус, Зураг 5f) эсийн хуваагдлын давтамж ижил төстэй байгааг олж мэдсэн бөгөөд энэ нь IPR болон IPR бус эсүүдийн хоорондох GA дохиоллын ялгаа нь эсийн хуваагдалд мэдэгдэхүйц нөлөөлдөггүй болохыг харуулж байна. Энэ болон GA дохиолол болон өсөлтийн анизотропийн хоорондын эерэг хамаарал нь биднийг GA дохиоллын идэвхжил нь эсийн хуваагдлын хавтгайн чиглэлд нөлөөлж чадах эсэхийг авч үзэхэд хүргэсэн. Бид шинэ эсийн хананы чиглэлийг меристемийн төв ба шинэ эсийн хананы төвийг холбосон радиаль тэнхлэгтэй харьцуулахад хурц өнцөг гэж хэмжсэн (Зураг 5e-i) бөгөөд эсүүд радиаль тэнхлэгтэй харьцуулахад 90° орчим өнцгөөр хуваагдах тодорхой хандлагатай байгааг ажигласан бөгөөд хамгийн өндөр давтамж нь 70–80° (23.28%) ба 80–90° (22.62%) (Зураг 5e,i)-д ажиглагдсан бөгөөд энэ нь тойрог/хөндлөн чиглэлд эсийн хуваагдалтай тохирч байна (Зураг 5h). Энэхүү эсийн хуваагдлын зан төлөвт GA дохиоллын хувь нэмрийг судлахын тулд бид IPR болон IPR бус эсийн хуваагдлын параметрүүдийг тусад нь шинжилсэн (Зураг 5i). Бид IPR эсүүдийн хуваагдлын өнцгийн тархалт нь IPR бус эсүүд эсвэл SAM-ийн бүх эсүүдээс ялгаатай байгааг ажигласан бөгөөд IPR эсүүд хажуугийн/дугуй эсийн хуваагдлын өндөр хувийг харуулсан, өөрөөр хэлбэл 70–80° ба 80–90° (тус тус 33.86% ба 30.71%) (Зураг 5i). Тиймээс бидний ажиглалтаар GA дохиоллын өндөр түвшин ба тойргийн чиглэлд ойрхон эсийн хуваагдлын хавтгайн чиглэлийн хоорондын холбоо нь GA дохиоллын идэвхжил ба өсөлтийн анизотропийн хоорондын хамааралтай төстэй болохыг харуулсан (Зураг 5c, d). Энэхүү холбоог орон зайн хадгалалтыг цаашид тогтоохын тулд бид P3-аас эхлэн анхдагч хэсгийг тойрсон IPR эсүүдийн хуваагдлын хавтгайн чиглэлийг хэмжсэн, учир нь энэ бүс нутагт P4-ээс эхлэн хамгийн өндөр GA дохиоллын идэвхжил илэрсэн (Зураг 4). P3 ба P4-ийн эргэн тойрон дахь IPR-ийн хуваагдлын өнцөг нь статистикийн хувьд мэдэгдэхүйц ялгаагүй байсан ч P4-ийн эргэн тойрон дахь IPR-д хажуугийн эсийн хуваагдлын давтамж нэмэгдсэн ажиглагдсан (Зураг 5j). Гэсэн хэдий ч P5 орчмын IPR эсүүдэд эсийн хуваагдлын хавтгайн чиглэлийн ялгаа нь статистикийн хувьд ач холбогдолтой болж, хөндлөн эсийн хуваагдлын давтамж огцом нэмэгдсэн (Зураг 5j). Эдгээр үр дүнгүүд нь GA дохиолол нь SAM дахь эсийн хуваагдлын чиглэлийг хянаж чаддаг болохыг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь өндөр GA дохиолол нь IPR дахь эсийн хуваагдлын хажуугийн чиглэлийг өдөөж болно гэсэн өмнөх тайлангуудтай нийцэж байна40,41.
IPR-ийн эсүүд анхдагч эсэд биш, харин зангилаа хоорондын эсэд нэгдэх болно гэж таамаглаж байна2,42,43. IPR-ийн эсийн хуваагдлын хөндлөн чиглэл нь зангилаа хоорондын эпидермисийн эсүүдийн зэрэгцээ уртрагийн эгнээний ердийн зохион байгуулалтад хүргэж болзошгүй юм. Дээр дурдсан бидний ажиглалтаас харахад GA дохиолол нь эсийн хуваагдлын чиглэлийг зохицуулснаар энэ үйл явцад чухал үүрэг гүйцэтгэдэг байх магадлалтай.
Хэд хэдэн DELLA генийн үйл ажиллагаа алдагдах нь GA-ийн үндсэн хариу урвал үүсгэдэг бөгөөд делла мутантуудыг энэ таамаглалыг шалгахад ашиглаж болно44. Бид эхлээд SAM дахь таван DELLA генийн илэрхийлэлийн хэв маягийг шинжилсэн. GUS шугамын45 транскрипцийн нэгдэл нь GAI, RGA, RGL1, болон RGL2 (хамгийн бага хэмжээгээр) нь SAM-д илэрхийлэгдсэн болохыг харуулсан (Нэмэлт Зураг 11a–d). In situ эрлийзжүүлэлт нь GAI mRNA нь анхдагч болон хөгжиж буй цэцэгт онцгойлон хуримтлагддаг болохыг харуулсан (Нэмэлт Зураг 11e). RGL1 болон RGL3 mRNA нь SAM бүрхүүлийн туршид болон хуучин цэцэгт илэрсэн бол RGL2 mRNA нь хилийн бүсэд илүү элбэг байсан (Нэмэлт Зураг 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM-ийн конфокал дүрслэл нь in situ эрлийзжүүлэлтээр ажиглагдсан илэрхийлэлийг баталгаажуулж, RGL3 уураг нь SAM-ийн төв хэсэгт хуримтлагддаг болохыг харуулсан (Нэмэлт Зураг 11i). pRGA::GFP-RGA шугамыг ашиглан бид RGA уураг SAM-д хуримтлагддаг боловч түүний элбэгшил P4-ээс эхлэн хил дээр буурдаг болохыг тогтоосон (Нэмэлт Зураг 11j). RGL3 болон RGA-ийн илэрхийлэлийн хэв маяг нь qmRGA-аар илрүүлсэн IPR-д GA дохиоллын идэвхжил өндөртэй нийцэж байгааг тэмдэглэх нь зүйтэй (Зураг 4). Түүнчлэн эдгээр өгөгдөл нь бүх DELLA нь SAM-д илэрхийлэгддэг бөгөөд тэдгээрийн илэрхийлэл нь SAM-ийг бүхэлд нь хамардаг болохыг харуулж байна.
Дараа нь бид зэрлэг хэлбэрийн SAM (Ler, хяналтын) болон gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quantuple (global) мутантуудын эсийн хуваагдлын параметрүүдийг шинжилсэн (Зураг 6a, b). Сонирхолтой нь, бид della global мутант SAM-д зэрлэг төрөлтэй харьцуулахад эсийн хуваагдлын өнцгийн давтамжийн тархалтад статистикийн хувьд мэдэгдэхүйц өөрчлөлт ажиглагдсан (Зураг 6c). della global мутант дахь энэхүү өөрчлөлт нь 80–90° өнцгийн давтамж (34.71% vs. 24.55%) болон бага хэмжээгээр 70–80° өнцгийн давтамж (23.78% vs. 20.18%) нэмэгдсэнтэй холбоотой, өөрөөр хэлбэл хөндлөн эсийн хуваагдалтай тохирч байна (Зураг 6c). Хөндлөн бус хуваагдлын давтамж (0–60°) della global мутантад мөн бага байсан (Зураг 6c). della global мутант SAM-д хөндлөн эсийн хуваагдлын давтамж мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (Зураг 6b). IPR дахь хөндлөн эсийн хуваагдлын давтамж нь зэрлэг төрөлтэй харьцуулахад della global мутантад мөн өндөр байсан (Зураг 6d). IPR бүсээс гадна зэрлэг төрөл нь эсийн хуваагдлын өнцгийн илүү жигд тархалттай байсан бол della global мутант нь IPR шиг тангенциал хуваагдлыг илүүд үздэг (Зураг 6e). Мөн бид GA хуримтлагддаг GA-идэвхгүй мутант дэвсгэр болох ga2 оксидаза (ga2ox) таван мутант (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, болон ga2ox6-2)-ийн SAM-д эсийн хуваагдлын чиглэлийг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон. GA түвшин нэмэгдэхтэй зэрэгцэн таван ga2ox мутант баг цэцгийн SAM нь Col-0-оос том байсан (Нэмэлт Зураг 12a, b) бөгөөд Col-0-той харьцуулахад таван ga2ox SAM нь эсийн хуваагдлын өнцгийн тархалтын мэдэгдэхүйц өөр байгааг харуулсан бөгөөд өнцгийн давтамж 50°-аас 90° хүртэл нэмэгдэж, өөрөөр хэлбэл тангенциал хуваагдлыг дахин дэмжиж байв (Нэмэлт Зураг 12a–c). Тиймээс бид GA дохиоллын үндсэн идэвхжил болон GA хуримтлал нь IPR болон SAM-ийн үлдсэн хэсэгт хажуугийн эсийн хуваагдлыг өдөөдөг болохыг харуулж байна.
a, b Конфокал микроскоп ашиглан PI-ээр будсан Ler (a) болон глобал делла мутант (b) SAM-ийн L1 давхаргын 3 хэмжээст дүрслэл. 10 цагийн хугацаанд SAM-д (гэхдээ примордиум биш) үүссэн шинэ эсийн ханыг харуулж, өнцгийн утгуудын дагуу будсан. Оруулгад 0 цагийн SAM-ийг харуулав. Өнгөний мөрийг баруун доод буланд харуулав. (b) дахь сум нь глобал делла мутант дахь эгнүүлсэн эсийн файлуудын жишээг заана. Туршилтыг ижил төстэй үр дүнтэй хоёр удаа давтсан. ce Ler болон глобал деллагийн хоорондох SAM (d), IPR (e) болон IPR бус (f) дахь эсийн хуваагдлын хавтгайн чиглэлийн давтамжийн тархалтын харьцуулалт. P утгыг хоёр сүүлт Колмогоров-Смирновын тест ашиглан олж авсан. f, g Col-0 (i) болон pCUC2::gai-1-VENUS (j) трансген ургамлын PI-ээр будсан SAM-ийн конфокал зургуудын 3 хэмжээст дүрслэл. (a, b) самбарууд нь SAM-д 10 цагийн дотор үүссэн шинэ эсийн хана (гэхдээ примордиа биш)-ийг харуулж байна. Туршилтыг хоёр удаа давтан хийж, ижил төстэй үр дүнд хүрсэн. h–j Col-0 болон pCUC2::gai-1-VENUS ургамлын хооронд SAM (h), IPR (i) болон IPR бус (j) бүхэл хэсэгт байрлах эсийн хуваагдлын хавтгайн чиглэлийн давтамжийн тархалтыг харьцуулсан. P утгыг хоёр сүүлт Колмогоров-Смирновын тест ашиглан олж авсан.
Дараа нь бид GA дохиоллыг IPR-д тусгайлан дарангуйлах нөлөөг туршсан. Үүний тулд бид VENUS-тэй нийлсэн (pCUC2::gai-1-VENUS шугамд) давамгайлсан сөрөг gai-1 уургийн экспрессийг өдөөхийн тулд котиледон аяга 2 (CUC2) промоторыг ашигласан. Зэрлэг хэлбэрийн SAM-д CUC2 промотор нь P4-ээс эхлэн хилийн эсүүдийг оролцуулан SAM-д ихэнх IPR-ийн экспрессийг өдөөдөг бөгөөд pCUC2::gai-1-VENUS ургамалд ижил төстэй өвөрмөц экспресс ажиглагдсан (доор үзнэ үү). pCUC2::gai-1-VENUS ургамлын SAM эсвэл IPR дээрх эсийн хуваагдлын өнцгийн тархалт нь зэрлэг хэлбэрийнхээс мэдэгдэхүйц ялгаатай биш байсан ч гэнэтийн байдлаар эдгээр ургамалд IPR-гүй эсүүд 80-90° өндөр давтамжтайгаар хуваагддаг болохыг бид олж мэдсэн (Зураг 6f-j).
Эсийн хуваагдлын чиглэл нь SAM-ийн геометрээс, ялангуяа эдийн муруйлтаас үүссэн суналтын стрессээс хамаардаг гэж үздэг46. Тиймээс бид della global мутант болон pCUC2::gai-1-VENUS ургамалд SAM-ийн хэлбэр өөрчлөгдсөн эсэхийг асуусан. Өмнө нь мэдээлснээр12, della global мутант SAM-ийн хэмжээ нь зэрлэг төрөлтэй харьцуулахад том байсан (Нэмэлт Зураг 13a, b, d). CLV3 болон STM РНХ-ийн in situ эрлийзжилт нь della мутантуудад меристемийн тэлэлтийг баталгаажуулж, үүдэл эсийн үүрний хажуугийн тэлэлтийг харуулсан (Нэмэлт Зураг 13e, f, h, i). Гэсэн хэдий ч SAM муруйлт нь хоёр генотипт ижил төстэй байсан (Нэмэлт Зураг 13k, m, n, p). Бид gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple мутантад зэрлэг төрөлтэй харьцуулахад муруйлт өөрчлөгдөөгүй хэмжээний ижил төстэй өсөлтийг ажигласан (Нэмэлт Зураг 13c, d, g, j, l, o, p). Эсийн хуваагдлын чиглэлийн давтамж нь della quadruple мутантад мөн нөлөөлсөн боловч della monolith мутантаас бага хэмжээгээр нөлөөлсөн (Нэмэлт Зураг 12d–f). Энэхүү тунгийн нөлөө нь муруйлтад нөлөө үзүүлэхгүй байгаатай хамт Della quadruple мутант дахь үлдэгдэл RGL3 идэвхжил нь DELLA идэвхжилийн алдагдлын улмаас үүссэн эсийн хуваагдлын чиглэлийн өөрчлөлтийг хязгаарлаж, хажуугийн эсийн хуваагдлын өөрчлөлт нь SAM геометрийн өөрчлөлтөөс илүү GA дохиоллын идэвхжилийн өөрчлөлтөд хариу үйлдэл үзүүлдэг болохыг харуулж байна. Дээр дурдсанчлан, CUC2 промотор нь P4-ээс эхлэн SAM-д IPR экспрессийг өдөөдөг (Нэмэлт Зураг 14a, b) бөгөөд үүний эсрэгээр pCUC2::gai-1-VENUS SAM нь хэмжээ нь багассан боловч муруйлт нь өндөр байсан (Нэмэлт Зураг 14c–h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM морфологийн энэхүү өөрчлөлт нь зэрлэг төрөлтэй харьцуулахад механик стрессийн өөр тархалтыг үүсгэж болзошгүй бөгөөд өндөр тойргийн стресс нь SAM төвөөс богино зайд эхэлдэг47. Эсвэл pCUC2::gai-1-VENUS SAM морфологийн өөрчлөлт нь трансген экспрессийн өдөөгдсөн бүс нутгийн механик шинж чанарын өөрчлөлтөөс үүдэлтэй байж болно48. Хоёр тохиолдолд хоёуланд нь энэ нь эсүүд тойргийн/хөндлөн чиглэлд хуваагдах магадлалыг нэмэгдүүлснээр GA дохиоллын өөрчлөлтийн нөлөөг хэсэгчлэн нөхөж болох бөгөөд энэ нь бидний ажиглалтыг тайлбарлаж байна.
Бидний өгөгдөл нь IPR дахь эсийн хуваагдлын хавтгайн хажуугийн чиглэлд өндөр GA дохиолол идэвхтэй үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг баталж байна. Мөн тэдгээр нь меристемийн муруйлт нь IPR дахь эсийн хуваагдлын хавтгайн чиглэлд нөлөөлдөг болохыг харуулж байна.
GA дохиоллын өндөр идэвхжилээс шалтгаалан IPR дахь хуваах хавтгайн хөндлөн чиглэл нь GA нь SAM доторх эпидермис дэх радиаль эсийн файлыг урьдчилан зохион байгуулж, дараа нь эпидермисийн завсрын зангилаанд байрлах эсийн зохион байгуулалтыг тодорхойлдог болохыг харуулж байна. Үнэндээ ийм эсийн файлууд нь della global мутантуудын SAM зургуудад байнга харагдаж байсан (Зураг 6b). Тиймээс SAM дахь GA дохиоллын орон зайн хэв маягийн хөгжлийн функцийг цаашид судлахын тулд бид зэрлэг төрөл (Ler ба Col-0), della global мутантууд болон pCUC2::gai-1-VENUS трансген ургамал дахь IPR дахь эсийн орон зайн зохион байгуулалтыг шинжлэхийн тулд цагийн урсгалын дүрслэлийг ашигласан.
Бид qmRGA нь IPR дахь GA дохиоллын идэвхжил P1/P2-оос нэмэгдэж, P4 дээр оргил үедээ хүрсэн бөгөөд энэ хэв маяг цаг хугацааны явцад тогтмол хэвээр байгааг харуулсан болохыг тогтоосон (Зураг 4a–f болон Нэмэлт Зураг 8c–f, k). GA дохио нэмэгдэж байгаатай холбогдуулан IPR дахь эсүүдийн орон зайн зохион байгуулалтыг шинжлэхийн тулд бид Ler IPR эсүүдийг P4-ийн дээд ба хажуу талууд руу анхны ажиглалтаас хойш 34 цагийн дараа шинжилсэн хөгжлийн хувь тавилангаар нь, өөрөөр хэлбэл хоёроос дээш удаа пластидын удаа тэмдэглэсэн бөгөөд энэ нь бидэнд P1/P2-оос P4 хүртэлх анхдагч хөгжлийн явцад IPR эсүүдийг дагаж мөрдөх боломжийг олгосон. Бид гурван өөр өнгийг ашигласан: P4-ийн ойролцоо анхдагч хэсэгт нэгтгэгдсэн эсүүдэд шар, IPR-д байсан эсүүдэд ногоон, хоёр процесст оролцсон эсүүдэд нил ягаан (Зураг 7a–c). t0 (0 цаг) үед P4-ийн урд 1-2 давхар IPR эсүүд харагдаж байсан (Зураг 7a). Хүлээгдэж байсанчлан эдгээр эсүүд хуваагдах үед голчлон хөндлөн хуваах хавтгайгаар дамжин хуваагдсан (Зураг 7a–c). Үүнтэй төстэй үр дүнг Col-0 SAM ашиглан олж авсан (P3 дээр анхаарлаа төвлөрүүлсэн бөгөөд түүний хил нь Лерт P4-тэй төстэй нугалдаг), гэхдээ энэ генотипт цэцгийн хил дээр үүссэн нугалаа нь IPR эсүүдийг илүү хурдан нуусан (Зураг 7g–i). Тиймээс IPR эсүүдийн хуваагдлын хэв маяг нь эсүүдийг зангилаа хоорондын адил радиаль эгнээ болгон урьдчилан зохион байгуулдаг. Радиаль эгнээний зохион байгуулалт болон IPR эсүүдийн дараалсан эрхтнүүдийн хооронд байршил нь эдгээр эсүүд нь зангилаа хоорондын өвөг дээдэс болохыг харуулж байна.
Энд бид GA болон GA рецепторын хосолсон концентрациас үүдэлтэй GA дохиоллын идэвхжилийг тоон зураглал хийх боломжийг олгодог харьцааны GA дохиоллын биосенсор болох qmRGA-г боловсруулсан бөгөөд энэ нь эндоген дохиоллын замуудтай хөндлөнгөөс оролцохыг багасгахын зэрэгцээ эсийн түвшинд GA-ийн үйл ажиллагааны талаар мэдээлэл өгөх боломжийг олгодог. Үүний тулд бид DELLA харилцан үйлчлэлийн түншүүдийг холбох чадвараа алдсан боловч GA-ийн өдөөгдсөн протеолизд мэдрэмтгий хэвээр байгаа өөрчлөгдсөн DELLA уураг болох mRGA-г бүтээсэн. qmRGA нь GA түвшний экзоген болон эндоген өөрчлөлтүүдэд хариу үйлдэл үзүүлдэг бөгөөд түүний динамик мэдрэхүйн шинж чанарууд нь хөгжлийн явцад GA дохиоллын идэвхжилийн орон зайн-цаг хугацааны өөрчлөлтийг үнэлэх боломжийг олгодог. qmRGA нь мөн маш уян хатан хэрэгсэл бөгөөд үүнийг илэрхийлэхдээ ашигласан промоторыг (шаардлагатай бол) өөрчлөх замаар өөр өөр эдэд дасан зохицож болох бөгөөд GA дохиоллын зам болон ангиосперм дээрх PFYRE мотивын хадгалагдсан шинж чанарыг харгалзан үзвэл бусад зүйлд шилжүүлэх магадлалтай22. Үүнтэй уялдуулан будааны SLR1 DELLA уургийн (HYY497AAA) эквивалент мутаци нь SLR1-ийн өсөлтийг дарангуйлагч идэвхийг дарангуйлахын зэрэгцээ mRGA23-тай төстэй GA-зуучлалтай задралыг бага зэрэг бууруулдаг болохыг харуулсан. Arabidopsis-д хийсэн саяхны судалгаагаар PFYRE домэйн (S474L) дахь ганц амин хүчлийн мутаци нь RGA-ийн транскрипцийн идэвхийг транскрипцийн хүчин зүйлийн түншүүдтэй харилцан үйлчлэх чадварт нь нөлөөлөхгүйгээр өөрчилсөн болохыг харуулсан50. Энэхүү мутаци нь mRGA-д байдаг 3 амин хүчлийн орлуулалттай маш ойрхон боловч бидний судалгаагаар эдгээр хоёр мутаци нь DELLA-ийн өвөрмөц шинж чанарыг өөрчилдөг болохыг харуулж байна. Хэдийгээр транскрипцийн хүчин зүйлийн ихэнх түншүүд DELLA26,51-ийн LHR1 болон SAW домэйнуудтай холбогддог ч PFYRE домэйн дэх зарим хадгалагдсан амин хүчлүүд нь эдгээр харилцан үйлчлэлийг тогтворжуулахад тусалдаг.
Зангилаа хоорондын хөгжил нь ургамлын архитектур болон ургацын сайжруулалтын гол шинж чанар юм. qmRGA нь IPR зангилаа хоорондын өвөг эсүүдэд GA дохиоллын идэвхжил өндөр байгааг илрүүлсэн. Тоон дүрслэл болон генетикийг хослуулснаар бид GA дохиоллын хэв маяг нь SAM эпидермис дэх дугуй/хөндлөн эсийн хуваагдлын хавтгайг давхцуулж, зангилаа хоорондын хөгжилд шаардлагатай эсийн хуваагдлын зохион байгуулалтыг бүрдүүлдэг болохыг харуулсан. Хөгжлийн явцад эсийн хуваагдлын хавтгайн чиглэлийн хэд хэдэн зохицуулагчийг тодорхойлсон52,53. Бидний ажил нь GA дохиоллын идэвхжил нь энэхүү эсийн параметрийг хэрхэн зохицуулдаг талаар тодорхой жишээг харуулж байна. DELLA нь урьдчилан нугалах уургийн цогцолборуудтай харилцан үйлчилж чаддаг41 тул GA дохиолол нь кортикал микротубулын чиглэлд шууд нөлөөлөх замаар эсийн хуваагдлын хавтгайн чиглэлийг зохицуулж болно40,41,54,55. Бид гэнэтийн байдлаар SAM-д GA дохиоллын өндөр идэвхжилийн хамаарал нь эсийн суналт эсвэл хуваагдал биш, харин зөвхөн өсөлтийн анизотропи гэдгийг харуулсан бөгөөд энэ нь IPR дахь эсийн хуваагдлын чиглэлд GA-ийн шууд нөлөөтэй нийцдэг. Гэсэн хэдий ч энэ нөлөө нь шууд бус байж болохыг үгүйсгэх аргагүй, жишээлбэл, GA-ээр өдөөгдсөн эсийн ханын зөөлрөлтөөр зуучлагддаг56. Эсийн ханын шинж чанарын өөрчлөлт нь механик стрессийг үүсгэдэг57,58 бөгөөд энэ нь кортикал микротубулуудын чиглэлд нөлөөлж эсийн хуваагдлын хавтгайн чиглэлд нөлөөлж болно39,46,59. GA-ийн өдөөгдсөн механик стресс болон GA-ийн микротубулын чиглэлийг шууд зохицуулах хосолсон нөлөө нь IPR-д эсийн хуваагдлын чиглэлийн тодорхой хэв маягийг бий болгоход оролцож болох бөгөөд энэ санааг шалгахын тулд цаашид судалгаа хийх шаардлагатай байна. Үүнтэй адилаар өмнөх судалгаанууд нь DELLA-тай харилцан үйлчлэлцдэг TCP14 ба 15 уургууд нь зангилааны хоорондын үүсэлтийг хянахын ач холбогдлыг онцолсон60,61 бөгөөд эдгээр хүчин зүйлүүд нь зангилааны хоорондын хөгжлийг зохицуулдаг BREVIPEDICELLUS (BP) болон PENNYWISE (PNY)-тай хамт GA-ийн үйлдлийг зуучилж болох бөгөөд GA дохиололд нөлөөлдөг болох нь батлагдсан2,62. DELL нь брассиностероид, этилен, жасмоны хүчил, абсцисийн хүчил (ABA) дохиоллын замуудтай харилцан үйлчилдэг63,64 бөгөөд эдгээр дааврууд нь микротубулын чиглэлд65 нөлөөлж чаддаг тул эсийн хуваагдлын чиглэлд GA-ийн нөлөөг бусад дааврууд зуучилж болно.
Эрт үеийн цитологийн судалгаагаар Arabidopsis SAM-ийн дотор болон гадна хэсгүүд нь зангилаа хоорондын хөгжилд шаардлагатай болохыг харуулсан2,42. GA нь дотор эд эсийн хуваагдлыг идэвхтэй зохицуулдаг12 нь SAM-д меристем ба зангилаа хоорондын хэмжээг зохицуулахад GA-ийн давхар үүргийг дэмждэг. Чиглэлийн эсийн хуваагдлын хэв маяг нь дотоод SAM эдэд мөн нягт зохицуулагддаг бөгөөд энэхүү зохицуулалт нь ишний өсөлтөд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг52. GA нь дотоод SAM зохион байгуулалтад эсийн хуваагдлын хавтгайг чиглүүлэхэд үүрэг гүйцэтгэдэг эсэхийг судлах нь сонирхолтой байх болно, ингэснээр SAM доторх зангилаа хоорондын тодорхойлолт болон хөгжлийг синхрончилдог.
Ургамлыг хөрсөнд эсвэл 1% сахароз, 1% агар (Sigma)-аар баяжуулсан 1 ширхэг Мурашиге-Скуг (MS) орчинд (Duchefa) стандарт нөхцөлд (16 цаг гэрэлтэй, 22 °C) in vitro ургуулсан, харин суулгацыг тогтмол гэрэлтэй, 22 °C-д босоо хавтан дээр ургуулсан гипокотил ба үндэсний өсөлтийн туршилтаас бусад тохиолдолд. Нитратын туршилтын хувьд ургамлыг урт өдрийн нөхцөлд хангалттай нитрат (0 эсвэл 10 мМ KNO3), 0.5 мМ NH4-сукцинат, 1% сахароз, 1% А-агар (Sigma)-аар баяжуулсан өөрчлөгдсөн MS орчинд (bioWORLD ургамлын орчин) ургуулсан.
pDONR221-д оруулсан GID1a кДНХ-г pDONR P4-P1R-pUBQ10 болон pDONR P2R-P3-mCherry-тэй pB7m34GW руу дахин нэгтгэж pUBQ10::GID1a-mCherry үүсгэсэн. pDONR221-д оруулсан IDD2 ДНХ-г pB7RWG266 руу дахин нэгтгэж p35S:IDD2-RFP үүсгэсэн. pGID1b::2xmTQ2-GID1b үүсгэхийн тулд GID1b кодлох бүсийн дээд хэсэгт байрлах 3.9 kb фрагмент болон GID1b кДНХ (1.3 kb) болон терминатор (3.4 kb) агуулсан 4.7 kb фрагментийг эхлээд Нэмэлт Хүснэгт 3-т байгаа праймеруудыг ашиглан олшруулж, дараа нь pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) болон pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific)-д тус тус оруулж, эцэст нь Gateway клонинг ашиглан pDONR221 2xmTQ268-тай pGreen 012567 зорилтот вектор руу дахин нэгтгэсэн. pCUC2::LSSmOrange үүсгэхийн тулд CUC2 промоутер дараалал (ATG-ээс дээш 3229 bp), дараа нь N7 цөмийн байршлын дохио болон NOS транскрипцийн терминатор бүхий том Стокс шилжсэн mOrange (LSSmOrange)69 кодлох дарааллыг Gateway 3-фрагментийн рекомбинацийн систем (Invitrogen) ашиглан pGreen канамицин чиглүүлэх векторт угсарсан. Ургамлын хоёртын векторыг Agrobacterium tumefaciens GV3101 омогт оруулж, Nicotiana benthamiana навчнуудад Agrobacterium нэвчилтийн аргаар, Arabidopsis thaliana Col-0-д цэцгийн дүрэлтийн аргаар тус тус оруулсан. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry болон pCLV3::mCherry-NLS qmRGA-г тус тусын эрлийзүүдийн F3 ба F1 үр удамаас тус тус тусгаарласан.
РНХ-г in situ эрлийзжүүлэлтийг ойролцоогоор 1 см урттай найлзуурын үзүүрүүд дээр хийсэн72 бөгөөд тэдгээрийг цуглуулж, 4°C хүртэл урьдчилан хөргөсөн FAA уусмалд (3.7% формальдегид, 5% цууны хүчил, 50% этанол) нэн даруй бэхэлсэн. 2 × 15 минутын вакуум боловсруулалтын дараа бэхлэгчийг сольж, дээжийг шөнийн турш инкубацлав. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, болон RGL3 кДНХ болон антисенс зондуудыг тэдгээрийн 3′-UTR-д Розьер болон бусад хүмүүсийн тайлбарласны дагуу Нэмэлт Хүснэгт 3-т үзүүлсэн праймеруудыг ашиглан нийлэгжүүлсэн.73. Дигоксигенинээр тэмдэглэгдсэн зондуудыг дигоксигенины эсрэгбие (3000 дахин шингэрүүлэлт; Roche, каталогийн дугаар: 11 093 274 910) ашиглан дархлаа илрүүлж, хэсгүүдийг 5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат (BCIP, 250 дахин шингэрүүлэлт)/нитроблю тетразолиум (NBT, 200 дахин шингэрүүлэлт) уусмалаар будсан.
Нийтэлсэн цаг: 2025 оны 2-р сарын 10