Гельминтийн эсрэг эм N,N-диэтил-м-толуамид (DEET) нь AChE (ацетилхолинестераза)-г дарангуйлдаг бөгөөд хэт их судасжилтаас болж хорт хавдар үүсгэх шинж чанартай байдаг гэж мэдээлсэн. Энэхүү өгүүлэлд бид DEET нь ангиогенезийг дэмждэг эндотелийн эсийг өдөөж, улмаар хавдрын өсөлтийг нэмэгдүүлдэг болохыг харуулж байна. DEET нь ангиогенезд хүргэдэг эсийн процессуудыг идэвхжүүлдэг бөгөөд үүнд тархалт, шилжилт хөдөлгөөн, наалдац орно. Энэ нь эндотелийн эсүүдэд NO үйлдвэрлэл болон VEGF экспресс нэмэгдсэнтэй холбоотой юм. M3-ийг чимээгүй болгох эсвэл эмийн M3 дарангуйлагчийг хэрэглэх нь эдгээр бүх нөлөөг арилгаж, DEET-ээр өдөөгдсөн ангиогенез нь M3-д мэдрэмтгий болохыг харуулж байна. Эндотел болон HEK эсүүдэд кальцийн дохиолол M3 рецепторыг хэт их илэрхийлдэг, мөн холбох болон холбох судалгаанууд нь DEET нь M3 рецепторын аллостерик модулятор болж ажилладаг болохыг харуулж байна. Цаашилбал, DEET нь AChE-г дарангуйлж, улмаар ацетилхолины биоидэвхжил болон M3 рецептортой холбогдохыг нэмэгдүүлж, аллостерик зохицуулалтаар дамжуулан проангиогенийн нөлөөг сайжруулдаг.
Анхдагч EC-үүдийг Швейцарийн хулгануудын аортоос ялгаж авсан. Олборлох аргыг Кобаяши протокол 26-аас авсан. Хулганы EC-үүдийг дөрөв дэх гарц хүртэл 5% дулаанаар идэвхгүйжүүлсэн FBS-ээр баяжуулсан EBM-2 орчинд өсгөвөрлөв.
HUVEC, U87MG, эсвэл BF16F10-ийн тархалтад DEET-ийн хоёр концентрацийн нөлөөг CyQUANT эсийн тархалтын шинжилгээний хэрэгсэл (Molecular Probes, C7026) ашиглан шинжилсэн. Товчхондоо, нүх тус бүрт 5.103 эсийг 96 нүхтэй хавтан дээр суулгаж, хонуулж, дараа нь DEET-ээр 24 цагийн турш боловсруулсан. Өсөлтийг арилгасны дараа микро хавтангийн нүх бүрт будагч бодис холбох уусмал нэмж, эсүүдийг 37 °C-д 30 минутын турш инкубацлав. Флуоресценцийн түвшинг 485 нм өдөөх шүүлтүүр болон 530 нм ялгаруулалтын шүүлтүүрээр тоноглогдсон Mithras LB940 олон горимтой микро хавтангийн уншигч (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Герман) ашиглан тодорхойлсон.
HUVEC-ийг 96 нүхтэй хавтан дээр нүх тус бүрт 104 эсийн нягтралтайгаар үржүүлсэн. Эсүүдийг DEET-ээр 24 цагийн турш боловсруулсан. Эсийн амьдрах чадварыг колориметрийн MTT шинжилгээ (Sigma-Aldrich, M5655) ашиглан үнэлсэн. Оптик нягтралын утгыг 570 нм долгионы уртад олон горимтой микро хавтан уншигч (Mithras LB940) дээр авсан.
DEET-ийн нөлөөг in vitro ангиогенезийн шинжилгээг ашиглан судалсан. 10-8 M эсвэл 10-5 M DEET-ээр эмчлэх нь HUVEC-д хялгасан судасны урт үүсэхийг нэмэгдүүлсэн (Зураг 1a, b, цагаан баар). Хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад 10-14-10-5 M хооронд хэлбэлздэг DEET-ийн концентрацитай эмчилгээ нь хялгасан судасны урт 10-8 M DEET-д тэгш түвшинд хүрсэн болохыг харуулсан (Нэмэлт Зураг S2). 10-8 M ба 10-5 M концентрацийн хүрээнд DEET-ээр эмчилсэн HUVEC-ийн in vitro ангиогенезийн нөлөөнд мэдэгдэхүйц ялгаа ажиглагдаагүй.
DEET-ийн неоваскуляржилтад үзүүлэх нөлөөг тодорхойлохын тулд бид in vivo неоваскуляржуулалтын судалгаа хийсэн. 14 хоногийн дараа 10-8 M эсвэл 10-5 M DEET-ээр урьдчилан өсгөвөрлөсөн эндотелийн эсүүдийг тарьсан хулгануудад гемоглобины агууламж мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (Зураг 1c, цагаан баар).
Цаашилбал, DEET-ээр өдөөгдсөн неоваскуляризацийг U87MG ксенотрансплантаттай хулгануудад өдөр бүр (ip) DEET-ээр тарьсан бөгөөд энэ нь хүмүүст хэвийн үзэгдэл бөгөөд 23-т илэрдэг. Илрүүлж болох хавдар (өөрөөр хэлбэл >100 мм3 хавдар) нь U87MG эсийг хулганад тарьснаас хойш 14 хоногийн дараа ажиглагдсан. 28 дахь өдөр хяналтын хулгануудтай харьцуулахад DEET-ээр эмчилсэн хулгануудад хавдрын өсөлт мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (Зураг 1d, квадратууд). Цаашилбал, хавдрын CD31 будгаар будахад DEET нь хялгасан судасны талбайг мэдэгдэхүйц нэмэгдүүлсэн боловч бичил судасны нягтралыг нэмэгдүүлээгүй болохыг харуулсан (Зураг 1e–g).
DETA-ээр өдөөгдсөн тархалт дахь мускарин рецепторуудын үүргийг тодорхойлохын тулд pFHHSiD (10-7 M, сонгомол M3 рецепторын антагонист)-ийн дэргэд 10-8 M эсвэл 10-5 M DETA хэрэглэсэн. HUVEC-ээр эмчлэх нь pFHHSiD нь бүх концентрацид DETA-ийн тархалтын шинж чанарыг бүрэн хаадаг (Хүснэгт 1).
Эдгээр нөхцөлд бид DEET нь HUVEC эсүүдэд хялгасан судасны уртыг нэмэгдүүлэх эсэхийг судалсан. Үүнтэй адилаар, pFHHSiD нь DEET-ээр өдөөгдсөн хялгасан судасны уртыг мэдэгдэхүйц саатуулсан (Зураг 1a, b, саарал баар). Цаашилбал, ижил төстэй туршилтуудыг M3 siRNA-тай хийсэн. Хяналтын siRNA нь хялгасан судасны үүсэлтийг дэмжихэд үр дүнтэй биш байсан ч M3 мускарин рецепторыг чимээгүй болгосноор DEET-ийн хялгасан судасны уртыг нэмэгдүүлэх чадварыг үгүй хийсэн (Зураг 1a, b, хар баар).
Цаашилбал, 10-8 M эсвэл 10-5 M DEET-ээр өдөөгдсөн in vitro судасжилт болон in vivo неоваскуляржилт хоёулаа pFHHSiD-ээр бүрэн хаагдсан (Зураг 1c, d, тойрог). Эдгээр үр дүнгээс харахад DEET нь сонгомол M3 рецепторын антагонист эсвэл M3 siRNA-д мэдрэмтгий замаар ангиогенезийг дэмждэг.
AChE нь DEET-ийн молекулын бай юм. AChE дарангуйлагчийн үүрэг гүйцэтгэдэг донепезил зэрэг эмүүд нь in vitro болон хулганы хойд мөчний ишемийн загваруудад EC ангиогенезийг өдөөж чаддаг14. Бид HUVEC-д AChE ферментийн идэвхжилд DEET-ийн хоёр концентрацийн нөлөөг туршсан. DEET-ийн бага (10-8 M) ба өндөр (10-5 M) концентраци нь хяналтын нөхцөлтэй харьцуулахад эндотелийн AChE идэвхжилийг бууруулсан (Зураг 2).
DEET-ийн хоёр концентраци (10-8 M ба 10-5 M) нь HUVEC дээрх ацетилхолинэстеразын идэвхийг бууруулсан. BW284c51 (10-5 M)-ийг ацетилхолинэстеразын дарангуйлагчийн хяналтын бүлэг болгон ашигласан. Үр дүнг HUVEC дээрх DEET-ийн хоёр концентрацитай AChE идэвхжилийн хувиар илэрхийлсэн бөгөөд тээврийн хэрэгслээр эмчилсэн эсүүдтэй харьцуулсан болно. Утгыг зургаан бие даасан туршилтын дундаж ± SEM гэж илэрхийлсэн. *p < 0.05 нь хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад (Крускал-Уоллис ба Данн олон харьцуулалтын тест).
Азотын исэл (NO) нь ангиогенийн процесст оролцдог 33 тул DEET-ээр өдөөгдсөн HUVEC-д NO үйлдвэрлэлийг судалсан. DEET-ээр эмчилсэн эндотелийн NO үйлдвэрлэлийг хяналтын эсүүдтэй харьцуулахад нэмэгдүүлсэн боловч зөвхөн 10-8 М тунгаар ач холбогдолтой болсон (Зураг 3c). DEET-ээр өдөөгдсөн NO үйлдвэрлэлийг хянадаг молекулын өөрчлөлтийг тодорхойлохын тулд eNOS-ийн илэрхийлэл болон идэвхжлийг Вестерн блоттингоор шинжилсэн. DEET эмчилгээ нь eNOS-ийн илэрхийлэлийг өөрчлөөгүй ч eNOS фосфоржуулалтад эмчлээгүй эсүүдтэй харьцуулахад идэвхжүүлэх цэгтээ (Ser-1177) eNOS фосфоржуулалтыг мэдэгдэхүйц нэмэгдүүлж, дарангуйлах цэгээ (Thr-495) бууруулсан (Зураг 3d). Цаашилбал, фосфоржуулсан eNOS-ийн хэмжээг ферментийн нийт хэмжээнд хэвийн болгосны дараа идэвхжүүлэх цэг болон дарангуйлах цэг дэх фосфоржуулсан eNOS-ийн харьцааг тооцоолсон. Энэ харьцаа нь эмчлээгүй эсүүдтэй харьцуулахад DEET-ийн концентраци бүрээр эмчилсэн HUVEC-д мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (Зураг 3d).
Эцэст нь, гол проангиоген хүчин зүйлсийн нэг болох VEGF-ийн илэрхийлэлийг Вестерн блоттингоор шинжилсэн. DEET нь VEGF-ийн илэрхийлэлийг мэдэгдэхүйц нэмэгдүүлсэн бол pFHHSiD нь энэ илэрхийлэлийг бүрэн хаасан.
DEET-ийн нөлөө нь фармакологийн хориг болон M3 рецепторын бууралтын аль алинд нь мэдрэмтгий тул бид DEET нь кальцийн дохиоллыг сайжруулж болзошгүй гэсэн таамаглалыг туршиж үзсэн. Гайхалтай нь, DEET нь ашигласан концентрацийн аль алинд нь HUVEC (өгөгдлийг харуулаагүй) болон HEK/M3 (Зураг 4a, b) дахь цитоплазмын кальцийг нэмэгдүүлж чадаагүй.
Нийтэлсэн цаг: 2024 оны 12-р сарын 30