Ангельминтик эм N,N-диэтил-м-толуамид (DEET) нь AChE (ацетилхолинэстераза)-ыг дарангуйлдаг бөгөөд хэт их судасжилтын улмаас хорт хавдар үүсгэх шинж чанартай байдаг. Энэ нийтлэлд бид DEET нь ангиогенезийг дэмждэг эндотелийн эсийг тусгайлан өдөөж, улмаар хавдрын өсөлтийг нэмэгдүүлдэг болохыг харуулсан. DEET нь пролифераци, шилжилт хөдөлгөөн, наалдац зэрэг ангиогенезид хүргэдэг эсийн процессыг идэвхжүүлдэг. Энэ нь эндотелийн эсэд NO-ийн үйлдвэрлэл болон VEGF-ийн илэрхийлэл нэмэгдсэнтэй холбоотой юм. M3-ийн дууг хаах эсвэл фармакологийн M3 дарангуйлагчийг ашиглах нь эдгээр бүх нөлөөг арилгасан нь DEET-ээр үүсгэгдсэн ангиогенез нь M3-т мэдрэмтгий болохыг харуулж байна. М3 рецепторыг хэт их хэмжээгээр илэрхийлдэг эндотелийн болон HEK эсүүдэд кальцийн дохиололтой холбоотой туршилтууд, түүнчлэн холбох болон залгах судалгаанууд нь DEET нь M3 рецепторуудын аллостерик модуляторын үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг харуулж байна. Цаашилбал, DEET нь AChE-ийг дарангуйлж, улмаар ацетилхолины био хүртээмжийг нэмэгдүүлж, M3 рецепторуудтай холбогдож, аллостерийн зохицуулалтаар дамжуулан проангиоген нөлөөг сайжруулдаг.
Анхдагч EC-ийг Швейцарийн хулганын аортоос тусгаарласан. Олборлох аргыг Кобаяши протоколоос тохируулсан 26 . Хулганы EC-ийг 5%-ийн халуунд идэвхгүйжүүлсэн FBS агуулсан EBM-2 орчинд дөрөв дэх гарц хүртэл өсгөвөрлөсөн.
DEET-ийн хоёр концентрацийн HUVEC, U87MG эсвэл BF16F10-ийн тархалтад үзүүлэх нөлөөг CyQUANT эсийн үржлийн шинжилгээний хэрэгсэл (Молекул датчик, C7026) ашиглан шинжилсэн. Товчхондоо, нэг цооногийн 5.103 эсийг 96 цооногийн хавтанд суулгаж, хонуулж, дараа нь DEET-ээр 24 цагийн турш эмчилсэн. Өсөлтийн орчинг зайлуулсны дараа бичил хавтангийн нүх тус бүрт будаг холбох уусмал нэмж, эсийг 37 ° C-т 30 минутын турш өсгөвөрлөнө. Флюресценцийн түвшинг 485 нм өдөөх шүүлтүүр, 530 нм ялгаралтын шүүлтүүрээр тоноглогдсон Mithras LB940 олон горимт микроплит уншигч (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Герман) ашиглан тодорхойлсон.
HUVEC-ийг 96 цооногийн ялтсанд 104 эсийн нягтралтайгаар суулгасан. Эсүүдийг DEET-ээр 24 цагийн турш эмчилсэн. Эсийн амьдрах чадварыг колориметрийн MTT шинжилгээ (Sigma-Aldrich, M5655) ашиглан үнэлэв. Оптик нягтын утгыг 570 нм долгионы урттай олон горимт микроплит уншигч (Mithras LB940) дээр авсан.
DEET-ийн нөлөөг in vitro ангиогенезийн шинжилгээг ашиглан судалсан. 10-8 М эсвэл 10-5 М DEET-тэй эмчилгээ хийснээр HUVEC-д хялгасан судасны урт үүсэхийг нэмэгдүүлсэн (Зураг 1a, b, цагаан баар). Хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад DEET-ийн 10-14-10-5 М-ийн концентрацитай эмчилгээ нь хялгасан судасны урт нь 10-8 М DEET-ийн тэгш өндөрлөгт хүрсэн болохыг харуулсан (Нэмэлт зураг S2). 10-8 М ба 10-5 М концентрацийн мужид DEET-ээр эмчилсэн HUVEC-ийн in vitro проангиоген нөлөөнд мэдэгдэхүйц ялгаа олдсонгүй.
DEET-ийн шинэ судасжилтад үзүүлэх нөлөөг тодорхойлохын тулд бид in vivo neovascularization судалгаа хийсэн. 14 хоногийн дараа 10-8 М эсвэл 10-5 М DEET-ээр урьдчилан өсгөвөрлөсөн эндотелийн эсийг тарьсан хулганад гемоглобины агууламж мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн байна (Зураг 1c, цагаан баар).
Цаашилбал, DEET-ээр өдөөгдсөн неоваскуляржилтыг U87MG ксенографт агуулсан хулгануудад судалсан бөгөөд тэдгээр нь өдөр бүр (ip) DEET-ийг 10-5 М-ийн сийвэнгийн концентрацийг өдөөдөг тунгаар тарьсан бөгөөд энэ нь өртсөн хүний хувьд хэвийн үзэгдэл юм. онд 23. Хулганад U87MG эсийг тарьснаас хойш 14 хоногийн дараа илрэх боломжтой хавдар (жишээ нь >100 мм3 хавдар) ажиглагдсан. 28 дахь өдөр DEET-ээр эмчилсэн хулгануудад хавдрын өсөлт нь хяналтын хулгануудтай харьцуулахад мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (Зураг 1d, квадрат). Цаашилбал, хавдрыг CD31-ээр будсан нь DEET нь хялгасан судасны талбайг мэдэгдэхүйц ихэсгэсэн боловч бичил судасны нягтыг биш гэдгийг харуулсан. (Зураг 1e–g).
DETA-ийн өдөөгдсөн пролиферацид мускарин рецепторуудын үүргийг тодорхойлохын тулд pFHHSiD (10-7 М, сонгомол M3 рецепторын антагонист) байгаа тохиолдолд 10-8 М эсвэл 10-5 М DETA-г ашигласан. HUVEC-ийн эмчилгээ. pFHHSiD нь бүх концентрацид DETA-ийн пролифератив шинж чанарыг бүрэн хаасан (Хүснэгт 1).
Эдгээр нөхцөлд бид DEET нь HUVEC эсүүдэд хялгасан судасны уртыг нэмэгдүүлэх эсэхийг судалсан. Үүний нэгэн адил, pFHHSiD нь DEET-ийн өдөөгдсөн хялгасан судасны уртаас ихээхэн сэргийлдэг (Зураг 1a, b, саарал баар). Цаашилбал, ижил төстэй туршилтуудыг M3 siRNA-тай хийсэн. Хяналтын siRNA нь хялгасан судас үүсэхийг дэмжихэд үр дүнтэй биш байсан ч M3 мускарин рецепторыг дуугүй болгосноор DEET-ийн хялгасан судасны уртыг нэмэгдүүлэх чадварыг устгасан (Зураг 1a, b, хар баар).
Цаашилбал, 10-8 М эсвэл 10-5 М DEET-ээр өдөөгдсөн судасжилтыг in vitro болон neovascularization хоёулаа pFHHSiD-ээр бүрэн хаагдсан (Зураг 1c, d, тойрог). Эдгээр үр дүн нь DEET нь сонгомол M3 рецепторын антагонистууд эсвэл M3 siRNA-д мэдрэмтгий замаар ангиогенезийг дэмждэг болохыг харуулж байна.
AChE нь DEET-ийн молекулын зорилт юм. AChE дарангуйлагчийн үүрэг гүйцэтгэдэг донепезил зэрэг эмүүд нь in vitro болон хулганы арын мөчний ишемийн загварт EC ангиогенезийг өдөөж болно14. Бид HUVEC дахь AChE ферментийн идэвхжилд DEET-ийн хоёр концентрацийн нөлөөг туршиж үзсэн. DEET-ийн бага (10-8 М) ба өндөр (10-5 М) концентраци нь хяналтын нөхцөлтэй харьцуулахад эндотелийн AChE идэвхийг бууруулдаг (Зураг 2).
DEET-ийн концентраци (10-8 М ба 10-5 М) хоёулаа HUVEC дээрх ацетилхолинэстеразын идэвхийг бууруулдаг. BW284c51 (10-5 M) нь ацетилхолинестеразын дарангуйлагчдын хяналт болгон ашигласан. Үр дүнг тээврийн хэрэгслээр эмчилсэн эсүүдтэй харьцуулахад DEET-ийн хоёр концентрацитай эмчилсэн HUVEC дээрх AChE идэвхжилийн хувиар илэрхийлнэ. Утга нь бие даасан зургаан туршилтын дундаж ± SEM-ээр илэрхийлэгдэнэ. *хяналттай харьцуулахад p < 0.05 (Kruskal-Wallis болон Dunn олон харьцуулах тест).
Азотын исэл (NO) нь ангиоген процесс 33-д оролцдог тул DEET-ээр өдөөгдсөн HUVEC-д NO үйлдвэрлэлийг судалсан. DEET-ээр эмчилсэн эндотелийн NO-ийн үйлдвэрлэл хяналтын эсүүдтэй харьцуулахад нэмэгдсэн боловч зөвхөн 10-8 М тунгаар ач холбогдолтой болсон (Зураг 3c). DEET-ээр өдөөгдсөн NO-ийн үйлдвэрлэлийг хянадаг молекулын өөрчлөлтийг тодорхойлохын тулд eNOS-ийн илэрхийлэл ба идэвхжүүлэлтийг Western blotting-ээр шинжилсэн. Хэдийгээр DEET эмчилгээ нь eNOS-ийн илэрхийлэлд өөрчлөлт оруулаагүй ч, eNOS фосфоржилтын боловсруулаагүй эсүүдтэй харьцуулахад түүний идэвхжүүлэх хэсэгт (Ser-1177) eNOS фосфоржилтыг мэдэгдэхүйц нэмэгдүүлж, дарангуйлах талбайг (Thr-495) бууруулдаг (Зураг 3d). Цаашилбал, фосфоржуулсан eNOS-ийн хэмжээг ферментийн нийт хэмжээнд хэвийн болгосны дараа идэвхжүүлэх газар ба дарангуйлах цэг дэх фосфоржуулсан eNOS-ийн харьцааг тооцоолсон. Энэ харьцаа нь DEET-ийн концентрац бүрээр эмчилсэн HUVEC-д боловсруулаагүй эсүүдтэй харьцуулахад мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн байна (Зураг 3d).
Эцэст нь, проангиогенийн гол хүчин зүйлүүдийн нэг болох VEGF-ийн илэрхийлэлд Western blotting шинжилгээ хийсэн. DEET нь VEGF илэрхийлэлийг мэдэгдэхүйц ихэсгэсэн бол pFHHSiD энэ илэрхийлэлийг бүрэн хаасан.
DEET-ийн нөлөө нь фармакологийн түгжрэл, M3 рецепторыг бууруулах зохицуулалтад хоёуланд нь мэдрэмтгий байдаг тул бид DEET нь кальцийн дохиоллыг сайжруулж болзошгүй гэсэн таамаглалыг туршиж үзсэн. Хачирхалтай нь, DEET нь ашигласан концентрацийн аль алинд нь HUVEC (өгөгдлөө харуулаагүй) болон HEK/M3 (Зураг 4a, b) дахь цитоплазмын кальцийг нэмэгдүүлж чадаагүй юм.
Шуудангийн цаг: 2024 оны 12-р сарын 30-ны хооронд