Пестицид нь дэлхийн хүнсний хомсдолыг шийдвэрлэх, вектороор дамждаг хүний өвчинтэй тэмцэхэд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг. Гэсэн хэдий ч пестицидийн эсэргүүцлийн асуудал улам бүр нэмэгдэж байгаа нь дутуу ашиглагдаж буй байг чиглүүлдэг шинэ нэгдлүүдийг нээхийг яаралтай шаардаж байна. Шавьжны түр зуурын рецепторын потенциал (TRPV) сувгууд болох Наньжонг (Нан) болон идэвхгүй (Иав) нь гетерологийн суваг (Нан-Иав) үүсгэж, шавьжинд геотропизм, сонсгол, проприоцепцийг зуучилдаг механик мэдрэхүйн эрхтэнд байршдаг. Афидопирролидон (AP) зэрэг зарим пестицид нь тодорхойгүй механизмаар Нан-Иавыг чиглүүлдэг. AP нь цоолж сордог шавьж (гемиптеранс)-ын эсрэг үр дүнтэй бөгөөд утаслагны үйл ажиллагааг алдагдуулснаар хооллохоос сэргийлдэг. AP нь зөвхөн Нантай холбогдож чаддаг боловч зөвхөн Нан-Иав нь эндоген никотинамид (NAM) зэрэг агонистуудтай харилцан үйлчилж, улмаар сувгийн идэвхжил үзүүлдэг. Нан-Иав нь шавьж устгах бай болох боломжтой хэдий ч түүний сувгийн угсралт, зохицуулах холболтын цэгүүд, Ca2+-хамааралтай зохицуулалтын талаар бага мэдээлэлтэй бөгөөд энэ нь шавьж устгах цаашдын хөгжилд саад учруулдаг. Энэхүү судалгаанд крио-электрон микроскоп ашиглан Hemiptera шавьжны Nan-Iav-ийн бүтцийг кальмодулин-лигандгүй төлөвт, мөн анкирины давталтын цитоплазмын домэйн (ARD)-ийн хил дээр AP болон NAM-тэй хамт тодорхойлоход ашигласан. Гайхалтай нь бид Nan уураг өөрөө пентамер үүсгэж чаддаг бөгөөд энэ нь AP-зуучлалтай ARD харилцан үйлчлэлээр тогтворждог болохыг тогтоожээ. Энэхүү судалгаагаар шавьж устгах бодис ба агонистууд болон Nan-Iav-ийн хоорондох молекулын харилцан үйлчлэлийг илрүүлж, ARD-ийн сувгийн үйл ажиллагаа, угсралтад чухал ач холбогдлыг онцолж, Ca2+ зохицуулалтын механизмыг судалсан.
Дэлхийн уур амьсгалын өөрчлөлт улам бүр ширүүсч байгаа энэ үед дэлхийн хүнсний аюулгүй байдал доройтож байгаа нь 21-р зууны томоохон сорилтуудын нэг бөгөөд нийгэмд ноцтой үр дагавар авчирч байна.1,2Дэлхийн Эрүүл Мэндийн Байгууллагын "Дэлхийн хүнсний аюулгүй байдал, хоол тэжээлийн байдал 2023" (SOFI) тайланд дэлхий даяар ойролцоогоор 2.33 тэрбум хүн дунд болон хүнд хэлбэрийн хүнсний аюулгүй байдлын хомсдолд нэрвэгдэж байгаа нь удаан хугацааны турш тулгамдаж буй асуудал гэж тооцоолжээ.3,4Харамсалтай нь жил бүр ургацын 20-30% буюу түүнээс дээш хувь нь хортон шавьж, эмгэг төрүүлэгч бичил биетнээс болж алдагддаг бөгөөд дэлхийн дулаарал нь хортон шавьжны эсэргүүцэл болон ургацын эмзэг байдлыг улам бүр нэмэгдүүлнэ гэж тооцоолж байна.4,5,6,7,8Пестицидийн хөгжил нь ургацыг хортон шавьжнаас хамгаалах, вектороор дамждаг эмгэг төрүүлэгчдийн тархалтыг бууруулахад төдийгүй пестицидэд улам бүр тэсвэртэй болж буй денге халууралт, хумхаа, Чагас өвчин зэрэг вектороор дамждаг хүний өвчинтэй тэмцэхэд чухал ач холбогдолтой юм.5,9,10,11
Мэдрэлийн хортой шавьж устгах бодисын гол байнуудын дунд гетеротетрамер TRPV суваг болох Нанчунг (Нан)-Идэвхгүй (Iav) нь сүүлийн арван жилд л нээгдсэн шавьж устгах бодисын байнуудын нэг ангиллыг төлөөлдөг бөгөөд үүнд имидаклоприд, пираклостробин зэрэг худалдаанд гардаг шавьж устгах бодисууд багтдаг.12,13,14Хагас синтетик шавьж устгагч апидопирролифен (AP) нь саяхан боловсруулж, худалдаанд гаргасан бүтээгдэхүүн бөгөөд гол бүрэлдэхүүн хэсэг нь AP-г субнаномоляр идэвхжилийн түвшинд холбодог идэвхтэй шавьж устгагч Инскалис® юм.15AP нь тоос хүртээгч, ашигтай шавьж болон бусад зорилтот бус организмуудад бага зэргийн цочмог хордлого үзүүлдэг бөгөөд шошгоны зааврын дагуу хэрэглэвэл бусад шавьж устгах бодисын эсэргүүцлийг бууруулж чадна.16,17,18Нан ба Иав нь шавьжны төрөл зүйлд өргөн тархсан бөгөөд зөвхөн антенн болон мөчний хөвчний суналтын рецепторын мэдрэлийн эсүүдэд хамт илэрхийлэгддэг бөгөөд сонсгол, таталцлын мэдрэмж, проприоцепцид чухал үүрэгтэй.13,16,19,20,21,22AP, имидаклоприд, пираклостробин нь өвөрмөц механизмаар дамжуулан Нан-Иав цогцолборыг өдөөж, эцэст нь проприоцептив дохионы дамжуулалтыг дарангуйлдаг.13,16,23Агнуур, цагаан ялаа зэрэг цоолж хөхдөг шавьж (гемиптеран)-д проприоцепц алдагдах нь тэдний хооллох чадварыг бууруулж, эцэст нь үхэлд хүргэдэг.13,24Сонирхолтой нь, AP нь Nan-Iav цогцолборт өндөр хамааралтай, зөвхөн Nan-д бага хамааралтай байдаг. AP-г Nan-Iav-тай холбох нь цахилгаан гүйдэл үүсгэдэг боловч зөвхөн Nan-тай холбогдох нь сувгийн үйл ажиллагааг өдөөдөггүй. Iav өөрөө AP-тэй огт холбогддоггүй.16Энэ нь Nan болон Iav нь өөр өөр Nan-Iav сувгийн цогцолбор үүсгэхэд холбогдож болзошгүйг харуулж байна (жишээлбэл, өөр өөр стехиометрийн харьцаатай эсвэл ижил стехиометрийн харьцаанд өөр өөр зохицуулалттай) эсвэл AP нь олон газарт холбогдож болно. Цаашилбал, байгалийн агонист никотинамид (NAM) нь Drosophila Nan-Iav-тай микромолийн хамааралтайгаар холбогддог бөгөөд in vitro нөхцөлд aphids (AP)-тай төстэй нөлөө үзүүлдэг.16,25мөн aphids-ийн үржил шим, хооллолтыг саатуулж, эцэст нь тэдний үхэлд хүргэдэг25,26Эдгээр өгөгдөл нь олон асуултыг бий болгож байна. Жишээлбэл, Нан-Иав гетеродимер хэрхэн үүсдэг, жижиг молекулуудыг зохицуулахад ямар холбох цэгүүдийг ашигладаг, эдгээр жижиг молекулууд проприоцепцийг дарангуйлснаар сувгийн үйл ажиллагааг хэрхэн зохицуулдаг нь тодорхойгүй хэвээр байна. Цаашилбал, Нан өөрөө идэвхгүй бөгөөд AP-д бага хамааралтай байдаг бол Нан-Иав гетеродимер нь идэвхтэй бөгөөд AP-д илүү өндөр хамааралтай байдаг шалтгаанууд тодорхойгүй хэвээр байна. Эцэст нь, Нан-Иав функцийн Ca2+-аас хамааралтай зохицуулалт болон мэдрэлийн дохиоллын процесст хэрхэн нэгтгэгддэг талаар бага мэдээлэлтэй байна.13,21
Энэхүү судалгаанд криоэлектрон микроскоп, электрофизиологи, радиолиганд холбох техникийг хослуулан бид Nan-Iav-ийн угсралт болон жижиг молекулын зохицуулагчидтай холбогдох механизмыг тодруулсан. Цаашилбал, бид Iav болон AP-тогтворжуулсан Nan пентамеруудтай тогтмол холбогдсон кальмодулин (CaM)-ийг илрүүлсэн. Эдгээр үр дүнгүүд нь суваг дахь кальцийн ионуудын зохицуулалт, сувгийн угсралт, лигандтай холбогдох хамаарлыг тодорхойлдог хүчин зүйлсийн талаар чухал ойлголт өгдөг. Хамгийн чухал нь бид ARD нь эдгээр процесст гол үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг баталсан. Холбогдох хөдөө аж ахуйн пестицидтэй холбогдсон шавьжны бүрэн сувгуудын судалгаа.27, 28, 29пестицидийн үйлдвэрлэлийг хөгжүүлэх хэтийн төлөвийг нээж, пестицидийн үр нөлөө, өвөрмөц чанарыг сайжруулж, дэлхийн хүнсний аюулгүй байдал, вектороор дамжих өвчний тархалтыг шийдвэрлэхийн тулд TRPV-д чиглэсэн нэгдлүүдийг бусад зүйлд хэрэглэх боломжийг олгодог.
Мөн бид Nan-Iav нь Ca2+-ээр зохицуулагддаг бөгөөд зохицуулалтын механизм нь CaM-ээр зохицуулагддаг болохыг тогтоосон. Чухал зүйл бол CaM-ээр Nav-ийн Ca2+-аас хамааралтай энэхүү зохицуулалт нь бусад ионы сувгуудын (жишээлбэл, хүчдэлээр хязгаарлагдсан Na+ суваг болон TRPV5/6 суваг) зохицуулалтын механизмаас эрс ялгаатай юм.52,53,54,55,56,57Nav1.2 сувагт CaM-ийн C-терминалын домэйн нь C-терминалын домэйн (CTD)-тэй спираль хэлбэрээр холбогддог бөгөөд Ca2+ нь өөрийн N-терминалын домэйныг CTD-ийн дистал хэсэгт холбоход хүргэдэг.56TRPV5/6 сувагт CaM-ийн С-терминалын домэйн нь CTH-тэй холбогддог бөгөөд Ca2+ нь түүний N-терминалын домэйныг нүх сүв рүү дээш өргөтгөж, улмаар катионы нэвчилтийг хаадаг.53,54Бид Nan-Iav-CaM-ийн Ca2+-зохицуулалттай функцийн загварыг санал болгож байна (Зураг 4h). Энэ загварт CaM-ийн N-төгсгөлийн домэйн нь Iav-ийн C-төгсгөлийн домэйн (CTH)-тэй тогтмол холбогддог. Амрах төлөвт (бага [Ca2+] концентраци) CaM-ийн C-төгсгөлийн домэйн нь Nan-тэй харилцан үйлчилж, ARD-ийн бүтцийг тогтворжуулж, улмаар сувгийн нээлтийг дэмждэг. Агонист/шавьж устгах бодисыг сувагт холбох нь нүх сүвийг нээхэд хүргэдэг бөгөөд энэ нь Ca2+ урсгалд хүргэдэг. Дараа нь Ca2+ нь CaM-тэй холбогдож, Nan-ийн ARD-ээс C-төгсгөлийн домэйныг диссоциацид хүргэдэг. CaM холболтыг хаах нь Ca2+-ийн дарангуйлах нөлөөг үндсэндээ арилгадаг тул энэхүү диссоциаци нь ARD-ийн хөдөлгөөнийг зохицуулж, улмаар Ca2+-аас хамааралтай дарангуйлал эсвэл мэдрэг чанаргүйжүүлэлтийг үүсгэдэг. Кальцийн ионы элюцийн дараа сувгийн урсгал хурдан сэргэдэг (Зураг 4g) нь энэхүү механизм нь Ca2+-зуучлалтай мэдрэлийн дохионд хурдан хариу үйлдэл үзүүлэхэд тусалдаг болохыг харуулж байна. Цаашилбал, Iav-ийн C-терминалын бүс нь сайн ойлгогдоогүй хэвээр байгаа бөгөөд сувгийн зорилтот түвшин болон одоогийн зохицуулалтад бусад үүрэг гүйцэтгэдэг гэж мэдээлсэн.21
Эцэст нь бидний судалгаагаар хөдөө аж ахуйн ач холбогдолтой шавьж устгах үйлчилгээтэй TRP сувгийн цогцолборын өндөр нарийвчлалтай бүтцийг танилцуулж байна - энэ нь бидэнд өмнө нь мэдэгдээгүй нээлт юм. Бид шавьж устгах үйлчилгээтэй TRP сувгийн бүтэц, үйл ажиллагааг шавьжны эсэд биш харин хүний эсэд (HEK293S GnTi–) тодорхойлсон нь анхаарал татаж байна. Шавьж устгах үйлчилгээтэй тэмцэх чадвар нэмэгдэж, хүнсний аюулгүй байдал, эмгэг төрүүлэгчдэд үзүүлэх дарамт шахалт үргэлжилж байгаатай холбогдуулан бидний ажил хүний эрүүл мэнд, дэлхийн хүнсний аюулгүй байдлын ашиг тусын тулд шинэ шавьж устгах үйлчилгээтэй болоход туслах чухал мэдээллийг өгдөг. Судалгаагаар AP зэрэг шавьж устгах үйлчилгээтэй бодисууд нь шошгоны зааврын дагуу хэрэглэвэл зарим хортон шавьжийн эсрэг үр дүнтэй бөгөөд ашигтай тоос хүртэгчдэд цочмог хоруу чанар багатай тул байгаль орчны аюулгүй байдлыг нь харуулж байна.13,16Цаашилбал, шумуул дээр зарим AP деривативыг туршиж үзэхэд тэд эцэстээ нисэх чадвараа алддаг болохыг харуулсан. Эдгээр зохицуулагч нэгдлүүд нь Nan-Iav-тай хэрхэн холбогддогийг ойлгох нь одоо байгаа нэгдлүүдийг өөрчлөх эсвэл илүү үр дүнтэй, шинэ нэгдлүүдийг боловсруулахад дөхөм болно.нарийнхортон шавьж устгах. Бидний судалгаагаар Nan-Iav ARD интерфейс нь зөвхөн эндоген нэгдлүүд, пестицид, Ca2+-CaM-ийн идэвхийг зохицуулахад төдийгүй сувгийн угсралтад чухал үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг харуулж байна. Бид жижиг молекулуудтай гетеродимер угсралтыг тасалдуулах нь ионы сувгийн дарангуйлагчдыг боловсруулах өвөрмөц бөгөөд ирээдүйтэй арга байж болох юм гэж үзэж байна.
Найман ортолог генээс хүрэн цох (Halyomorpha halys)-ын бүрэн хэмжээний генүүдийг сонгосон бөгөөд угаалгын нунтагт маш сайн тогтвортой байдлыг харуулсан. Синтезжүүлсэн генүүдийг хүний илэрхийлэлд кодоноор оновчтой болгож, XhoI болон EcoRI хязгаарлалтын сайтуудыг ашиглан pBacMam pCMV-DEST вектор (Life Technologies) руу клончилсон. Энэ нь клонуудыг HRC-3C протеаза (PPX)-ээр хуваагддаг C-терминал GFP-FLAG-10xHis болон mCherry-FLAG-10xHis шошготой рамтай байлгахыг баталгаажуулж, бие даасан байдлыг бий болгосон.илэрхийлэлНанчунг болон Инактивийг pBacMam векторт клон хийхэд ашигласан праймерууд дараах байдалтай байв.
Бие даасан бөөмсийн микроскопын зургийг K3 камер болон Gatan BioQuantum энергийн шүүлтүүрээр тоноглогдсон Titan Krios G2 дамжуулалтын электрон микроскоп (FEI) дээр авсан. Микроскопыг 300 кэВ-д ажиллуулж, энергийн тохиргоо нь 20 эВ, дээжийн пикселийн хэмжээ 1.08 Å/пиксел (нэрлэсэн томруулалт 81,000x), фокусын градиент нь -0.8-аас -2.2 μм хүртэл хэлбэлзсэн. Видео бичлэгийг 25 e–px−1 s−1 нэрлэсэн тунгийн хурдтай, 2.4 секундын өртөлтийн хугацаатай, нийт тун нь ойролцоогоор 60 e–Å−2 бүхий Latitude S микроскоп (Gatan) ашиглан секундэд 40 фрэймээр гүйцэтгэсэн.
Цацраг туяагаар өдөөгдсөн хөдөлгөөний залруулга болон тунгийн жинлэлтийг RELION 4.061 дээрх MotionCor2 ашиглан хальсан дээр гүйцэтгэсэн. Тодруулагч дамжуулах функц (CTF) параметрийн тооцооллыг cryoSPARC дээр нөхөөс дээр суурилсан CTF тооцооллын аргыг ашиглан гүйцэтгэсэн62. CTF тохирох нягтрал ≥4 Å бүхий фотомикрографуудыг дараагийн шинжилгээнээс хассан. Ерөнхийдөө cryoSPARC дээр цэг сонгоход 500-1000 фотомикрографийн дэд хэсгийг ашигласан бөгөөд дараа нь загвар дээр суурилсан бөөмсийн сонголтын тодорхой лавлагаа зургийг авахын тулд шүүлтүүр хийсний дараа 2 хэмжээст ангиллын хэд хэдэн үе шатыг хийсэн. Дараа нь бөөмсийг 64 пикселийн хязгаарлах хайрцаг болон 4 нугалах бининг ашиглан гаргаж авсан. Хүсээгүй бөөмсийн ангиллыг арилгахын тулд 2 хэмжээст ангиллын хэд хэдэн үе шатыг гүйцэтгэсэн. Анхны 3 хэмжээст загварыг ab initio сэргээн босголт ашиглан сэргээн босгож, cryoSPARC дээр жигд бус сайжруулалт ашиглан сайжруулсан. 3 хэмжээст ангиллыг cryoSPARC эсвэл RELION дээр ARD олон янз байдалд үндэслэн гүйцэтгэсэн. Мембраны домэйнүүдийн мэдэгдэхүйц олон янз байдал ажиглагдаагүй. Бөөмсийг C1 ба C2 аргуудыг ашиглан цэвэршүүлсэн; өндөр C2 нягтралтай бөөмсийг C2-тэй харьцуулахад тэгш хэмтэй гэж үзэж, Байесийн цэвэршүүлэлт хийх зорилгоор RELION руу импортолсон. Дараа нь бөөмсийг эцсийн жигд бус болон орон нутгийн цэвэршүүлэлт хийх зорилгоор криоSPARC руу буцааж шилжүүлсэн. Эцсийн нягтрал болон бөөмсийн тоог Хүснэгт 1-д үзүүлэв.
Nan+AP пентамеруудыг боловсруулахдаа бид мембраны домэйнүүдийн (ялангуяа нүх сүвний хэсэг) нягтралыг сайжруулах янз бүрийн аргуудыг судалсан, тухайлбал дохио хасах болон TMD масклах. Гэсэн хэдий ч эдгээр оролдлогууд нь нүх сүвний хэсэг дэх хэт туйлын эмгэг болон TMD-ийн нийт олон янз байдлаас шалтгаалан амжилтгүй болсон. Эцсийн нягтралыг cryoSPARC дахь жигд бус боловсруулалтын аргаар автоматаар үүсгэсэн маск ашиглан тооцоолсон бөгөөд голчлон ARD хэсгийг чиглүүлсэн. Энэ нь мембраны домэйнүүдийн (ялангуяа VSLD хэсэг) нягтралыг мэдэгдэхүйц өндөр болгосон.
Нанчун болон Идэвхгүй алдаануудын apo хэлбэрийн анхны de novo загваруудыг анх Coot63 ашиглан үүсгэсэн бөгөөд Нан болон Иав алдаануудын загваруудыг AlphaFold264 ашиглан бага итгэл үнэмшилтэй бүс нутгийг тодорхойлох зорилгоор үүсгэсэн. Калмодулины загварчлалыг тус тус PDB 4JPZ56 болон 1CFD65-д Ca2+-холбогдох болон Ca2+-гүй загваруудын хатуу биетийн тохирол дээр үндэслэсэн. Загваруудыг зөв стереохими болон сайн геометрийг хангахын тулд бөмбөрцөг сайжруулалт ашиглан сайжруулсан. Дараа нь фосфатидилхолин, фосфатидилетаноламин, фосфатидилсериныг сайн тодорхойлсон липидийн нягтрал болгон загварчилж, NAM болон AP лигандуудыг нягт уулзварт харгалзах нягтралд байрлуулсан. PHENIX66 дахь eLBOW ашиглан изоформын SMILES мөрөөс хязгаарлалтын файлуудыг үүсгэсэн. Эцэст нь загваруудыг PHENIX дахь бодит орон зайд орон нутгийн сүлжээ хайлт болон хоёрдогч бүтцийн хязгаарлалттай дэлхийн минимумчлалыг ашиглан сайжруулсан. MolProbity серверийг загварыг боловсронгуй болгох, бүтцийн шинжилгээ хийхэд ашигласан бөгөөд дүрслэлийг PyMOL болон UCSF Chimera X ашиглан гүйцэтгэсэн. 67,68,69 Нүхний шинжилгээг HOLE сервер ашиглан гүйцэтгэсэн70 ба дарааллын хадгалалтын зураглалыг Consurf сервер ашиглан гүйцэтгэсэн.71
Статистикийн шинжилгээг Igor Pro 6.2, Excel Office 365, GraphPad Prism 7.0 ашиглан хийсэн. Бүх тоон өгөгдлийг дундаж ± стандарт алдаа (SEM) гэж үзүүлэв. Хоёр бүлгийг харьцуулахын тулд Стьюдентийн t-тестийг (хоёр сүүлт, хосгүй) ашигласан. Олон бүлгийг харьцуулахын тулд нэг талын дисперсийн шинжилгээ (ANOVA)-г дараа нь Даннеттийн пост-хок тестийг ашигласан. *P< 0.05, **P< 0.01, ба ***P< 0.001 нь өгөгдлийн тархалтаас хамааран статистикийн хувьд ач холбогдолтой гэж үзсэн. Kd, Ki утгууд болон тэдгээрийн тэгш бус 95%-ийн итгэх интервалуудыг GraphPad Prism 10 ашиглан тооцоолсон.
Судалгааны арга зүйн талаар дэлгэрэнгүй мэдээллийг энэ нийтлэлд байгаа Байгалийн портфолиогийн тайлангийн хураангуйгаас үзнэ үү.
Анхны загварыг PDB 4JPZ болон 1CFD мэдээллийн сангаас авсан кальмодулины загваруудыг ашиглан бүтээсэн. Координатуудыг 9NVN (лигандгүй Nan-Iav-CaM), 9NVO (никотинамидтай холбогдсон Nan-Iav-CaM), 9NVP (никотинамид ба EDTA-тай холбогдсон Nan-Iav-CaM), 9NVQ (афенидолпирроллин ба кальцитай холбогдсон Nan-Iav-CaM), 9NVR (афенидолпирроллин ба EDTA-тай холбогдсон Nan-Iav-CaM), болон 9NVS (афенидолпирроллинтой холбогдсон Nan пентамер) гэсэн бүртгэлийн дугааруудын дор Уургийн мэдээллийн санд (PDB) хадгалсан. Харгалзах крио-электрон микроскопын зургийг Электрон микроскопын мэдээллийн санд (EMDB) дараах бүртгэлийн дугааруудаар хадгалсан болно: EMD-49844 (лигандгүй Nan-Iav-CaM), EMD-49845 (никотинамидтай Nan-Iav-CaM цогцолбор), EMD-49846 (никотинамид ба EDTA бүхий Nan-Iav-CaM цогцолбор), EMD-49847 (афидопирроллин ба кальцитай Nan-Iav-CaM цогцолбор), EMD-49848 (афидопирроллин ба EDTA бүхий Nan-Iav-CaM цогцолбор), болон EMD-49849 (афидопирроллинтай Nan пентамер цогцолбор). Функциональ шинжилгээний түүхий өгөгдлийг энэхүү баримт бичигт үзүүлэв.
Нийтэлсэн цаг: 2026 оны 1-р сарын 28